Profesija ir molekulārais biologs. Molekulārais biologs

Molekulārā bioloģija, zinātne, kas par savu uzdevumu izvirza zināšanas par vitālās aktivitātes parādību būtību, pētot bioloģiskos objektus un sistēmas līmenī, kas tuvojas molekulārajam līmenim, un dažos gadījumos pat sasniedz šo robežu. Galīgais mērķis šajā gadījumā ir noskaidrot, kā un cik lielā mērā dzīves raksturīgās izpausmes, piemēram, iedzimtība, sava veida atražošana, olbaltumvielu biosintēze, uzbudināmība, izaugsme un attīstība, informācijas uzglabāšana un pārraide, enerģijas pārveidošana, mobilitāte utt. , ir saistītas ar bioloģiski svarīgu vielu, galvenokārt divu lielu molekulmasu biopolimēru - olbaltumvielu un nukleīnskābju - molekulu struktūru, īpašībām un mijiedarbību. Atšķirīga iezīme M. b. - dzīvības parādību izpēte uz nedzīviem priekšmetiem vai tiem, kas raksturīgi primitīvākajām dzīves izpausmēm. Šie ir bioloģiskie veidojumi no šūnu līmeņa un zemāk: apakššūnu organoīdi, piemēram, izolēti šūnu kodoli, mitohondriji, ribosomas, hromosomas, šūnu membrānas; tālāk - sistēmas, kas stāv uz dzīves robežas un nedzīvā daba, - vīrusi, ieskaitot bakteriofāgus, un beidzot ar dzīvās vielas vissvarīgāko komponentu molekulām - nukleīnskābēm un olbaltumvielām.

Pamatu, uz kura M. b. Attīstījās, lika tādas zinātnes kā ģenētika, bioķīmija, elementāru procesu fizioloģija utt. Saskaņā ar viņa attīstības izcelsmi M. b. nesaraujami saistīts ar molekulāro ģenētiku, kas joprojām ir nozīmīga

Atšķirīga iezīme M. dz. ir tā trīsdimensiju. M. būtība. M. Perucs to redz, interpretējot bioloģiskās funkcijas molekulārās struktūras ziņā. M. dz. mērķis ir iegūt atbildes uz jautājumu "kā", uzzinot visas molekulas struktūras lomas un līdzdalības būtību, un uz jautājumiem "kāpēc" un "kāpēc", no vienas puses, noskaidrojot saiknes starp molekulas īpašībām (atkal, galvenokārt, olbaltumvielām un nukleīnskābes) un tās veiktās funkcijas, un, no otras puses, šādu individuālo funkciju loma vispārējā vitālās aktivitātes izpausmju kompleksā.

Galvenie sasniegumi molekulārajā bioloģijā. Šeit ir tālu no pilnīga šo sasniegumu saraksta: DNS bioloģiskās funkcijas, visu RNS un ribosomu veidu struktūras un mehānisma atklāšana, ģenētiskā koda atklāšana; reversās transkripcijas atklāšana, t.i., DNS sintēze uz RNS šablona; elpošanas pigmentu darbības mehānismu izpēte; trīsdimensiju struktūras un tās funkcionālās lomas atklāšana enzīmu darbībā, matricas sintēzes princips un olbaltumvielu biosintēzes mehānismi; vīrusu struktūras un to replikācijas mehānismu, primārās un daļēji antivielu telpiskās struktūras atklāšana; atsevišķu gēnu izolēšana, ķīmiskā un pēc tam bioloģiskā (fermentatīvā) gēna, ieskaitot cilvēku, sintēze ārpus šūnas (in vitro); gēnu pārnese no viena organisma uz citu, arī cilvēka šūnās; strauji progresējoša arvien vairāku atsevišķu olbaltumvielu, galvenokārt enzīmu, kā arī nukleīnskābju ķīmiskās struktūras atšifrēšana; dažu pieaugošas sarežģītības pakāpes bioloģisko objektu "pašsavienošanās" parādību noteikšana, sākot no nukleīnskābes molekulām un pārejot uz daudzkomponentu enzīmiem, vīrusiem, ribosomām utt. alosterisko un citu bioloģisko funkciju un procesu regulēšanas pamatprincipu noskaidrošana.

Molekulārās bioloģijas problēmas. Kopā ar norādītajiem svarīgajiem M. b. (zināšanas par “atpazīšanas”, pašsapulcēšanās un integrācijas modeļiem) neatliekams zinātniskās meklēšanas virziens tuvākajā nākotnē ir tādu metožu izstrāde, kas ļauj dekodēt struktūru un pēc tam trīsdimensiju, telpiski organizēt augstas molekulārās nukleīnskābes. Visas svarīgākās metodes, kuru izmantošana nodrošināja medicīnas zinātnes rašanos un panākumus, ir ierosinājuši un izstrādājuši fiziķi (ultracentrifugēšana, rentgena strukturālā analīze, elektronu mikroskopija, kodolmagnētiskā rezonanse utt.). Gandrīz visas jaunās fiziskās eksperimentālās pieejas (piemēram, datoru izmantošana, sinhrotrona vai bremstrahlung starojums, lāzera tehnoloģija utt.) Paver jaunas iespējas padziļināts pētījums problēmas M. b. Starp vissvarīgākajiem praktiska rakstura uzdevumiem, uz kuriem atbilde tiek gaidīta no M. b., Pirmkārt, ir ļaundabīgas augšanas molekulāro pamatu problēma, pēc tam - iedzimtu slimību - "molekulāro slimību" - novēršanas un varbūt pārvarēšanas veidi. Liela nozīme tiks noskaidrots bioloģiskās katalīzes molekulārais pamats, tas ir, fermentu darbība. Starp svarīgākajiem mūsdienu virzieniem M. b. jāietver vēlme atšifrēt hormonu, toksisko un ārstniecisko vielu molekulāros darbības mehānismus, kā arī uzzināt sīkāku informāciju par šādu vielu molekulāro struktūru un darbību. šūnu struktūras, kā bioloģiskās membrānaspiedaloties vielu iekļūšanas un transportēšanas procesu regulēšanā. Tālāki mērķi M. b. - nervu procesu, atmiņas mehānismu utt. rakstura izziņa. Viena no svarīgākajām M. b. - tā sauktais. gēnu inženierija, kas par savu uzdevumu izvirza mērķtiecīgu dzīvo organismu ģenētiskā aparāta (genoma) darbību, sākot ar mikrobiem un zemākiem (vienšūņu) un beidzot ar cilvēkiem (pēdējā gadījumā galvenokārt iedzimtu slimību radikālas ārstēšanas un ģenētisko defektu labošanas nolūkā).

Vissvarīgākās MB jomas:

- Molekulārā ģenētika - šūnas ģenētiskā aparāta strukturālās un funkcionālās organizācijas un iedzimtas informācijas realizācijas mehānisma izpēte

- Molekulārā viroloģija - vīrusu un šūnu mijiedarbības molekulāro mehānismu izpēte

- Molekulārā imunoloģija - ķermeņa imūno reakciju modeļu izpēte

- Molekulārā attīstības bioloģija - pētījums par dažādu kvalitātes šūnu parādīšanos laikā individuālā attīstība organismu un šūnu specializācija

Galvenie pētījuma objekti: vīrusi (ieskaitot bakteriofāgus), šūnas un apakššūnu struktūras, makromolekulas, daudzšūnu organismi.

Molekulārā bioloģija / m ə lɛ uzDžʊ l.r / ir bioloģijas nozare, kas nodarbojas ar bioloģiskās aktivitātes molekulāro pamatu starp biomolekulām dažādās šūnu sistēmās, ieskaitot DNS, RNS, olbaltumvielu mijiedarbību un to biosintēzi, kā arī šo mijiedarbību regulēšanu. Ierakstīšana daba 1961. gadā Astberijs aprakstīja molekulāro bioloģiju:

Ne tik daudz tehnika kā pieeja, pieeja no tā saukto fundamentālo zinātņu viedokļa ar vadošo ideju meklēt zem klasiskās bioloģijas plaša mēroga izpausmēm atbilstošo molekulāro plānu. Tas jo īpaši attiecas uz formas bioloģiskās molekulas un [...] pārsvarā trīsdimensiju un struktūras - kas tomēr nenozīmē, ka tas ir tikai morfoloģijas uzlabojums. Viņam vienlaikus jāizpēta ģenēze un darbība.

Saistība ar citām bioloģijas zinātnēm

Pētnieki molekulārās bioloģijas jomā izmanto specifiskas molekulārās bioloģijas audzēšanas metodes, taču arvien vairāk tās apvieno ar ģenētikas un bioķīmijas metodēm un idejām. Starp šīm disciplīnām nav noteiktas robežas. Tas parādīts šajā diagrammā, kurā attēlots viens no iespējamajiem sakaru veidiem starp laukiem:

• Bioķīmija mācās ķīmiskās vielas dzīvībai svarīgos procesos. Bioķīmiķiem ir grūti koncentrēties uz biomolekulu lomu, funkciju un struktūru. Ķīmijas izpēte aiz bioloģiskajiem procesiem un bioloģiski aktīvo molekulu sintēze ir bioķīmijas piemēri.
• Ģenētika ir organismu ģenētisko atšķirību ietekmes izpēte. To bieži var secināt no normāla komponenta (piemēram, viena gēna) neesamības. Pētījuma "mutanti" - organismi, kuriem ir viens vai vairāki funkcionālie komponenti attiecībā pret tā dēvēto "savvaļas tipu" vai normālu fenotipu. Ģenētiskā mijiedarbība (epistaze) bieži tiek sajaukta ar šādu "nokautu" pētījumu vienkāršu interpretāciju.
• Molekulārā bioloģija ir replikācijas, transkripcijas, translācijas un šūnu funkcijas molekulārā pamata izpēte. Centrālā molekulārās bioloģijas dogma, kur ģenētiskais materiāls tiek pārrakstīts RNS un pēc tam pārvērsts olbaltumvielā, neskatoties uz tā vienkāršošanu, joprojām ir labs sākumpunkts lauka izpratnei. Attēls ir pārdefinēts, ņemot vērā RNS jaunās lomas.

Molekulārās bioloģijas metodes

Molekulārā klonēšana

Viena no elementārākajām molekulārās bioloģijas metodēm olbaltumvielu funkcijas izpētei ir molekulārā klonēšana. Šajā metodē DNS, kas kodē interesējošo proteīnu, klonē ar polimerāzes ķēdes reakciju (PCR) un / vai restrikcijas enzīmiem plazmīdā (ekspresijas vektors). Vektoram ir 3 specifiskas īpatnības: replikācijas sākums, daudzkārtēja klonēšanas vieta (MCS) un atlasāms marķieris, parasti izturīgs pret antibiotikām. Vairākas klonēšanas vietas augšpus straumes ir promotera reģioni un transkripcijas iniciācijas vietas, kas regulē klonētā gēna ekspresiju. Šo plazmīdu var ievietot baktēriju vai dzīvnieku šūnās. DNS ievadīšanu baktēriju šūnās var veikt, pārveidojot, izmantojot neapbruņotu DNS uzņemšanu, konjugāciju, izmantojot šūnu un šūnu kontaktus, vai ar transdukciju, izmantojot vīrusu vektoru. DNS ievadīšanu eikariotu šūnās, piemēram, dzīvnieku šūnās, ar fiziskiem vai ķīmiskiem līdzekļiem sauc par transfekciju. Ir pieejamas vairākas dažādas transfekcijas metodes, piemēram, kalcija fosfāta transfekcija, elektroporācija, mikroinjekcija un liposomu transfekcija. Plazmīdu var integrēt genomā, kā rezultātā tiek panākta stabila transfekcija, vai arī tā var palikt neatkarīga no genoma, ko sauc par pārejošu transfekciju.

DNS, kas kodē interesējošos proteīnus, tagad atrodas šūnā, un olbaltumvielas tagad var tikt izteiktas. Dažādas sistēmas, piemēram, inducējami promotori un specifiski šūnu signālu faktori, kas palīdzēs izteikt olbaltumvielu interesi par augsts līmenis... Pēc tam no baktēriju vai eikariotu šūnas var iegūt lielu daudzumu olbaltumvielu. Olbaltumvielu var pārbaudīt attiecībā uz fermentatīvo aktivitāti dažādās situācijās, olbaltumvielu var kristalizēt, tādējādi izpētot tā terciāro struktūru, vai arī farmācijas nozarē var izpētīt jaunu zāļu aktivitāti pret olbaltumvielām.

Polimerāzes ķēdes reakcija

Makromolekulu blotēšana un izpēte

Noteikumi ziemeļu , uz rietumiem un austrumu blotēšana izpaužas no tā, kas sākotnēji bija molekulārās bioloģijas joks, kas spēlēja šo terminu Southernnet , ievērojot Edvina Dienvidu aprakstīto procedūru BLOTTED DNS hibridizācijai. Patrīcija Tomass, RNS blotēšanas izstrādātāja, kas pēc tam kļuva pazīstama kā ziemeļi - blotēšana , īsti nelietojiet šo terminu.

Dienvidu blotēšana

Southern blot, kas nosaukts pēc izgudrotāja, biologa Edvina Southa, ir metode īpašas DNS sekvences klātbūtnes pārbaudei DNS paraugā. DNS paraugus pirms vai pēc restrikcijas enzīma (restrikcijas enzīma) šķelšanas atdala ar gēla elektroforēzi un pēc tam ar kapilāru darbību nosūta uz membrānu. Pēc tam membrānu pakļauj marķētai DNS zondei, kuras bāzes secība ir komplementāra tai, kas atrodas uz interesējošās DNS. Southern blotting zinātniskajā laboratorijā tiek izmantots mazāk, jo citu metožu, piemēram, PCR, spēja noteikt specifiskas DNS sekvences no DNS paraugiem. Šie bloti joprojām tiek izmantoti dažos gadījumos, piemēram, transgēnu kopiju skaita noteikšanai transgēnās pelēs vai embriju cilmes šūnu līniju izslēgšanas gēnu inženierijā.

Ziemeļu blotēšana

Northern blot diagramma

Austrumu blotēšana

Klīniskos pētījumus un medicīniskās terapijas, kas izriet no molekulārās bioloģijas, daļēji aptver gēnu terapija. Molekulārās bioloģijas vai molekulāro šūnu bioloģijas pieeju pielietošana medicīnā tagad tiek saukta par molekulāro medicīnu. Molekulārajai bioloģijai ir svarīga loma arī izglītības, darbību un noteikumu izpratnē dažādas daļas šūnas, kuras var izmantot, lai efektīvi mērķētu uz jaunām zālēm, diagnosticētu slimības un izprastu šūnu fizioloģiju.

turpmāka lasīšana

• Koens, SN, Čangs, NKD, Bojers, H. un Helings, RB Bioloģiski funkcionālo baktēriju plazmīdu uzbūve in vitro .

Nukleīnskābju un olbaltumvielu biosintēzes pētījumu sasniegumi ir radījuši virkni metožu, kurām ir liela nozīme medicīnā, lauksaimniecībā un vairākās citās nozarēs.

Pēc ģenētiskā koda un iedzimtas informācijas uzglabāšanas un realizēšanas pamatprincipu izpētes molekulārās bioloģijas attīstība nonāca strupceļā, jo nebija metožu, kas ļautu manipulēt ar gēniem, tos izolēt un mainīt. Šo metožu parādīšanās notika 20. gadsimta 70. un 80. gados. Tas deva spēcīgu impulsu šīs zinātnes jomas attīstībai, kas joprojām plaukst. Pirmkārt, šīs metodes attiecas uz atsevišķu gēnu iegūšanu un to ievadīšanu citu organismu šūnās (molekulārā klonēšana un transģenēze, PCR), kā arī metodes nukleotīdu secības noteikšanai gēnos (DNS un RNS sekvencēšana). Šīs metodes tiks sīkāk aplūkotas turpmāk. Mēs sāksim ar visvienkāršāko pamatmetodi - elektroforēzi un pēc tam pāriet uz sarežģītākām metodēm.

DNS ELEKTROFORĒZE

Tā ir pamata DNS tehnika, kas tiek izmantota kopā ar gandrīz visām citām metodēm, lai izolētu vēlamās molekulas un analizētu rezultātus. Lai atdalītu DNS fragmentus visā garumā, tiek izmantota gēla elektroforēzes metode. DNS ir skābe, tās molekulas satur fosforskābes atlikumus, kas sašķeļ protonu un iegūst negatīvu lādiņu (1. attēls).

Tāpēc elektriskajā laukā DNS molekulas pārvietojas uz anodu - pozitīvi uzlādētu elektrodu. Tas notiek elektrolīta šķīdumā, kas satur lādiņa nesējjonus, tāpēc šis šķīdums vada strāvu. Lai atdalītu fragmentus, tiek izmantots blīvs polimēra gēls (agaroze vai poliakrilamīds). DNS molekulas tajā iepinās jo vairāk, jo ilgākas tās ir, un tāpēc visgarākās molekulas pārvietojas vislēnāk, bet īsākās - visātrāk (2. att.). Pirms vai pēc elektroforēzes gēlu apstrādā ar krāsvielām, kas saistās ar DNS un fluorescē ultravioletajā gaismā, un tiek iegūts gēla joslu attēls (sk. 3. attēlu). Lai noteiktu parauga DNS fragmentu garumus, tos salīdzina ar marķieri - standarta garuma fragmentu kopumu, kas paralēli uzklāts uz tā paša gela (4. attēls).

Vissvarīgākie instrumenti darbam ar DNS ir fermenti, kas pārveido DNS dzīvās šūnās: DNS polimerāzes, DNS ligāzes un restrikcijas endonukleāzes vai restrikcijas endonukleāzes. DNS polimerāze veic matricas DNS sintēzi, kas ļauj DNS pavairot mēģenē. DNS ligāzes šūt kopā DNS molekulas vai dziedēt tajās esošās nepilnības. Ierobežojošās endonukleāzes, vai restrikcijas fermenti, sagriež DNS molekulas stingri noteiktās secībās, kas ļauj izgriezt atsevišķus fragmentus no kopējās DNS masas. Šie fragmenti dažos gadījumos var saturēt atsevišķus gēnus.

restrikcijas fermenti

Secības, kuras atpazīst restrikcijas endonukleāzes, ir simetriskas, un pārtraukumi var notikt šādas secības vidū vai ar nobīdi (vienā un tajā pašā vietā abos DNS pavedienos). Darbības shēma dažādi veidi restrikcijas fermenti ir parādīti attēlā. 1. Pirmajā gadījumā tiek iegūti tā sauktie "neasie" gali, bet otrajā - "lipīgie". Apakšdaļas "lipīgo" galu gadījumā ķēde izrādās īsāka nekā otra, tiek izveidota vienpavediena daļa ar simetrisku secību, kas abos galos ir vienāda.

Galīgās sekvences būs vienādas, ja jebkura DNS ir sašķelta ar doto restrikcijas enzīmu, un tās var atkārtoti piesaistīt, jo tām ir komplementāras sekvences. Tos var sasaistīt, izmantojot DNS ligāzi, lai izveidotu vienu molekulu. Tādējādi ir iespējams apvienot divu dažādu DNS fragmentus un iegūt t.s. rekombinantā DNS... Šī pieeja tiek izmantota molekulārās klonēšanas metodē, kas ļauj iegūt atsevišķus gēnus un ievadīt tos šūnās, kas var veidot gēnā kodētu olbaltumvielu.

molekulārā klonēšana

Molekulārajā klonēšanā tiek izmantotas divas DNS molekulas - ieliktnis, kas satur interesējošo gēnu, un vektors - DNS, kas kalpo kā nesējs. Ievietojums tiek "iešūts" vektorā, izmantojot enzīmus, lai iegūtu jaunu, rekombinantu DNS molekulu, pēc tam šī molekula tiek ievadīta saimniekorganisma šūnās, un šīs šūnas uz barības vielas veido kolonijas. Kolonija ir vienas šūnas pēcnācējs, tas ir, klons, visas kolonijas šūnas ir ģenētiski identiskas un satur to pašu rekombinanto DNS. No tā izriet termins "molekulārā klonēšana", tas ir, iegūstot šūnu klonu, kas satur mums interesējošu DNS fragmentu. Pēc tam, kad ir iegūtas kolonijas, kas satur mums interesējošu ieliktni, ir iespējams raksturot šo ieliktni ar dažādām metodēm, piemēram, lai noteiktu tā precīzu secību. Šūnas var arī ražot insertu kodētu proteīnu, ja tas satur funkcionālu gēnu.

Kad šūnās tiek ievadīta rekombinanta molekula, notiek šo šūnu ģenētiskā transformācija. Pārvērtības - organisma šūnas absorbcijas process no apkārtējās vides brīvas DNS molekulas un tā iekļaušanās genomā, kā rezultātā šūnā parādās jaunas iedzimtas pazīmes, kas raksturīgas DNS donora organismam. Piemēram, ja ievietotajā molekulā ir gēns rezistencei pret ampicilīna antibiotiku, tad transformētās baktērijas augs tās klātbūtnē. Pirms transformācijas ampicilīns izraisīja viņu nāvi, tas ir, pārveidotajās šūnās parādās jauna iezīme.

VEKTORI

Vektoram jābūt ar vairākām īpašībām:

Pirmkārt, tā ir salīdzinoši maza DNS molekula, ar kuru var viegli manipulēt.

Otrkārt, lai DNS varētu saglabāt un pavairot šūnā, tai jāietver noteikta secība, kas nodrošina tās replikāciju (replikācijas sākums vai replikācijas sākums).

Treškārt, tajā jābūt gēnu marķieris, kas nodrošina tikai to šūnu izvēli, kurās iekritis vektors. Parasti tie ir antibiotiku rezistences gēni - pēc tam antibiotikas klātbūtnē mirst visas šūnas, kas nesatur vektoru.

Gēnu klonēšanu visbiežāk veic baktēriju šūnās, jo tās ir viegli kultivējamas un ātri vairojas. Baktēriju šūna parasti satur vienu lielu apļveida DNS molekulu, vairākus miljonus bāzes pāru, kas satur visus baktērijām nepieciešamos gēnus - baktēriju hromosomu. Papildus tam dažām baktērijām ir mazs (vairāki tūkstoši bāzes pāru) apļveida DNS, ko sauc plazmīdas(2. attēls). Tie, tāpat kā galvenā DNS, satur nukleotīdu secību, kas nodrošina DNS spēju replikēties (ori). Plazmīdi atkārtojas neatkarīgi no galvenās (hromosomu) DNS, tāpēc šūnā tie atrodas lielā skaitā kopiju. Daudzas no šīm plazmīdām satur antibiotiku rezistences gēnus, lai atšķirtu plazmīdu saturošās šūnas no normālām šūnām. Biežāk tiek izmantoti plazmīdi, kas satur divus gēnus, nodrošinot izturību pret divām antibiotikām, piemēram, pret tetraciklīnu un amicilīnu. Ir vienkāršas metodes tādu plazmīdu DNS izolēšanai, kuros nav baktēriju galvenās hromosomas DNS.

PĀRTRAUKŠANAS NOZĪME

Tiek saukta gēnu pārnešana no viena organisma uz otru transģenēzeun šādi modificēti organismi - transgēns... Pārnesot gēnus mikroorganismu šūnās, tiek iegūti rekombinantie olbaltumvielu preparāti zāļu vajadzībām, jo \u200b\u200bīpaši cilvēku olbaltumvielas, kas neizraisa imūno atgrūšanu - interferoni, insulīns un citi olbaltumvielu hormoni, šūnu augšanas faktori, kā arī olbaltumvielas vakcīnu ražošanai. Sarežģītākos gadījumos, kad olbaltumvielu modifikācija pareizi notiek tikai eikariotu šūnās, tiek izmantotas transgēnu šūnu kultūras vai transgēni dzīvnieki, it īpaši mājlopi (galvenokārt kazas), kas nepieciešamos proteīnus izdala pienā, vai olbaltumvielas tiek izolētas no to asinīm. Tā iegūst antivielas, asins recēšanas faktorus un citas olbaltumvielas. Pēc transģenēzes metodes tiek iegūti kultūraugi, kas ir izturīgi pret herbicīdiem un kaitēkļiem un kuriem ir citas noderīgas īpašības. Ar transgēnu mikroorganismu palīdzību tie attīra notekūdeņi un cīnās ar piesārņojumu, ir pat transgēni mikrobi, kas var noārdīt eļļu. Turklāt transgēnas tehnoloģijas ir neaizstājamas zinātniskie pētījumi - bioloģijas attīstība mūsdienās nav iedomājama bez modifikācijas un gēnu pārneses metožu regulāras piemērošanas.

molekulārā klonēšanas tehnoloģija

ieliktņi

Lai iegūtu individuālu gēnu no jebkura organisma, no tā tiek izolēta visa hromosomu DNS un sašķelta ar vienu vai diviem restrikcijas enzīmiem. Fermenti tiek izvēlēti tā, lai tie nesagrieztu mums interesējošo gēnu, bet izdarītu pārtraukumus gar tā malām un plazmas DNS vienā pārtraukumā vienā no rezistences gēniem, piemēram, pret ampicilīnu.

Molekulārā klonēšanas process ietver šādas darbības:

Griešana un izšūšana - vienas rekombinantās molekulas konstruēšana no ieliktņa un vektora.

Transformācija ir rekombinantas molekulas ievadīšana šūnās.

Selekcija - to šūnu atlase, kuras saņēmušas ievietošanas vektoru.

griešana un šūšana

Plazmīdu DNS apstrādā ar tiem pašiem restrikcijas enzīmiem, un, ja tiek izvēlēts tāds restrikcijas ferments, kas plazmīdā ievada 1 spraugu, tā tiek pārveidota par lineāru molekulu. Tā rezultātā visu iegūto DNS fragmentu galiem ir vienādi lipīgi gali. Kad temperatūra tiek pazemināta, šie gali ir nejauši savienoti, un tie tiek piesaistīti DNS ligāzei (skat. 3. attēlu).

Tiek iegūts dažāda sastāva apļveida DNS maisījums: daži no tiem saturēs specifisku hromosomu DNS sekvenci, kas savienota ar baktēriju DNS, citi - hromosomu DNS fragmentus, kas savienoti kopā, un vēl citi - reducētu apļveida plazmīdu vai tā dimēru (4. attēls).

transformācija

Tad šis maisījums tiek veikts ģenētiskā transformācija baktērijas, kas nesatur plazmīdas. Pārvērtības - brīvas DNS molekulas absorbcijas process no organisma šūnas no vides un iekļaušana genomā, kā rezultātā šūnā parādās jaunas iedzimtas pazīmes, kas raksturīgas DNS donora organismam. Katrā šūnā var iekļūt un pavairot tikai viena plazmīda. Šādas šūnas novieto uz cietas barotnes, kurā ir antibiotika tetraciklīns. Šūnas, kuras nesaņēma plazmīdu, šajā barotnē neaugs, un šūnas, kas nes plazmīdu, veido kolonijas, no kurām katra satur tikai vienas šūnas pēcnācējus, t.i. visas kolonijas šūnas nes vienu un to pašu plazmīdu (sk. 5. att.).

Atlase

Tālāk uzdevums ir atlasīt tikai tās šūnas, kurās iekrita vektors ar iespraudumu, un atšķirt tās no šūnām, kurās bez ievietošanas tiek pārnēsāts tikai vektors vai arī tās vispār netiek pārnēsātas. Tiek izsaukts šis vēlamo šūnu atlases process audzēšana... Šim lietojumam selektīvie marķieri - parasti antibiotiku rezistences gēni vektorā, un selektīvie medijikas satur antibiotikas vai citas vielas, kas nodrošina izvēli.

Mūsu piemērā šūnas no kolonijām, kas audzētas ampicilīna klātbūtnē, tiek subkulturētas divās barotnēs: pirmajā ir ampicilīns, bet otrajā - tetraciklīns. Kolonijas, kas satur tikai plazmīdu, augs abās barotnēs, savukārt kolonijas ar ievietotu hromosomu DNS plazmidēs neaugs barotnē ar tetraciklīnu (5. att.). Starp tiem ar īpašām metodēm tiek atlasīti tie, kas satur mums interesējošo gēnu, audzē pietiekamā daudzumā un tiek izolēta plazmīda DNS. Atsevišķs interesējošais gēns no tā tiek izgriezts, izmantojot tos pašus restrikcijas fermentus, kas tika izmantoti rekombinantās DNS iegūšanai. Šī gēna DNS var izmantot, lai noteiktu nukleotīdu secību, ievadītu to organismā, lai iegūtu jaunas īpašības, vai sintezētu vēlamo olbaltumvielu. Šo gēnu izolēšanas metodi sauc molekulārā klonēšana.

Fluorcentējoši proteīni

Eukariotu organismu pētījumos ir ļoti ērti izmantot fluorescējošus proteīnus kā marķieru gēnus. Pirmā fluorescējošā proteīna gēns zaļš fluorescējošais proteīns (GFP) tika izolēts no medūzas Aqeuorea victoria un ievests dažādos paraugorganismos (sk. 6. att.). 2008. gadā O. Simomura, M. Chalfi un R. Tsien Nobela prēmija šī proteīna atklāšanai un lietošanai.

Tad tika izolēti citu fluorescējošu olbaltumvielu gēni - sarkans, zils, dzeltens. Šie gēni ir mākslīgi modificēti, lai iegūtu olbaltumvielas ar vēlamajām īpašībām. Fluorescējošo olbaltumvielu daudzveidība ir parādīta att. 7, kurā parādīts Petri trauks ar baktērijām, kas satur dažādu fluorescējošu olbaltumvielu gēnus.

fluorescējošu olbaltumvielu lietošana

Fluorescējošā olbaltumvielu gēnu var ligēt ar jebkura cita proteīna gēnu, tad translācijas laikā veidojas viens proteīns - translācijas fūzijas proteīns vai saplūšana (saplūšanas proteīns), kas fluorescē. Tādējādi jūs varat izpētīt, piemēram, jebkuru olbaltumvielu, kas interesē šūnu, lokalizāciju (atrašanās vietu), to kustību. Izsakot fluorescējošus proteīnus tikai dažu veidu šūnās, ir iespējams daudzšūnu organismā iezīmēt šāda veida šūnas (sk. 8. att. - peles smadzenes, kurās atsevišķiem neironiem ir dažādas krāsas sakarā ar noteiktu fluorescējošu olbaltumvielu gēnu kombināciju). Fluorescējošās olbaltumvielas ir neaizstājams līdzeklis mūsdienu molekulārajā bioloģijā.

PCR

Tiek saukta vēl viena gēnu iegūšanas metode polimerāzes ķēdes reakcija (PCR)... Tas ir balstīts uz DNS polimerāžu spēju pabeigt otro DNS virkni gar komplementa virkni, kā tas notiek šūnās DNS replikācijas laikā.

Replikācijas izcelsmi šajā metodē nosaka divi mazi DNS gabali, ko sauc par sēklas,vai grunti... Šie grunti papildina interesējošā gēna galus divos DNS virzienos. Pirmkārt, hromosomu DNS, no kuras gēns ir jāizolē, sajauc ar sēklām un karsē līdz 99 ° C. Tas noved pie ūdeņraža saišu plīsuma un DNS šķiedru atdalīšanas. Pēc tam temperatūra tiek pazemināta līdz 50-70 ° C (atkarībā no sēklu garuma un secības). Šajos apstākļos grunti tiek piestiprināti pie hromosomu DNS papildinošajiem reģioniem, veidojot regulāru dubultā spirāli (sk. 9. att.). Pēc tam pievieno visu četru DNS sintēzei nepieciešamo nukleotīdu un DNS polimerāzes maisījumu. Ferments pagarina praimeri, veidojot divpavedienu DNS, no kurienes tie ir piestiprināti, t.i. no gēna galiem līdz vienpavediena hromosomu molekulai.

Ja maisījumu atkal karsē, hromosomu un tikko sintezētās ķēdes izkliedējas. Pēc atdzesēšanas sēklas atkal pievienosies tām, kuras uzņem lielā daudzumā (sk. 10. att.).

Jaunizveidotajās ķēdēs tie piestiprināsies nevis pie tā gala, no kura sākās pirmā sintēze, bet gan pretējā galā, jo DNS ķēdes ir antiparalēlas. Tāpēc otrajā sintēzes ciklā šādās ķēdēs tiks pabeigta tikai gēnam atbilstošā secība (sk. 11. att.).

Šajā metodē izmanto termofīlo baktēriju DNS polimerāzi, kas spēj izturēt vārīšanos un darbojas 70-80 ° C temperatūrā, tā nav jāpievieno katru reizi, bet ir pietiekami, lai to pievienotu eksperimenta sākumā. Atkārtojot sildīšanas un dzesēšanas procedūras vienā secībā, mēs katrā ciklā varam divkāršot secību skaitu, ko abos galos ierobežo ieviestās sēklas (sk. 12. att.).

Pēc apmēram 25 šādiem cikliem gēna eksemplāru skaits palielināsies vairāk nekā miljons reizes. Šādus daudzumus var viegli atdalīt no hromosomu DNS, ko ievada mēģenē un izmanto dažādiem mērķiem.

dNS sekvencēšana

Vēl viens svarīgs sasniegums ir metožu izstrāde DNS nukleotīdu secības noteikšanai - dNS sekvencēšana(no angļu valodas secības - secība). Lai to izdarītu, ar vienu no aprakstītajām metodēm ir nepieciešams iegūt gēnus, kas ir tīri no citām DNS. Tad DNS šķipsnas atdala, karsējot, un tām pievieno grunti, kas marķēta ar radioaktīvo fosforu vai fluorescējošu etiķeti. Ņemiet vērā, ka tiek ņemta viena sēkla, kas papildina vienu šķiedru. Tad pievieno DNS polimerāzi un 4 nukleotīdu maisījumu. Šis maisījums ir sadalīts 4 daļās un katram tiek pievienots viens no nukleotīdiem, modificēts tā, lai tas nesatur hidroksilgrupu trešajā dezoksiribozes atomā. Ja šāds nukleotīds ir iekļauts sintezētajā DNS virknē, tā pagarināšana nevar turpināties, jo polimerāzei nebūs kur piestiprināt nākamo nukleotīdu. Tādēļ DNS sintēze tiek izbeigta pēc šāda nukleotīda iekļaušanas. Daudz mazāk šādu nukleotīdu, ko sauc par dideoksinukleotīdiem, tiek pievienots nekā parastajiem, tāpēc ķēdes pārtraukšana notiek tikai reizēm un katrā ķēdē dažādās vietās. Rezultāts ir dažāda garuma ķēžu sajaukums, katra galā ir viens un tas pats nukleotīds. Tādējādi ķēdes garums atbilst nukleotīdu skaitam pētītajā secībā, piemēram, ja mums bija adenil dideoksinukleotīds, un iegūtās ķēdes bija 2, 7 un 12 nukleotīdu garas, tad gēnā otrajā, septītajā un divpadsmitajā pozīcijā bija adenīns. Iegūto ķēžu maisījumu var viegli atdalīt pēc lieluma, izmantojot elektroforēzi, un sintezētās ķēdes var identificēt pēc rentgenstaru filmas radioaktivitātes (sk. 10. att.).

Izrādās attēls, kas parādīts figūras apakšā, ko sauc par radioautogrāfu. Virzoties pa to no apakšas uz augšu un lasot burtu virs katras zonas kolonnām, iegūstam nukleotīdu secību, kas parādīta attēlā pa labi no autogrāfa. Izrādījās, ka sintēzi aptur ne tikai dideoksinukleotīdi, bet arī nukleotīdi, kuros kāda trešā cukura pozīcijā ir pievienota kāda ķīmiska grupa, piemēram, fluorescējoša krāsa. Ja katrs nukleotīds tiek apzīmēts ar savu krāsu, tad sintezēto šķiedru atdalīšanas laikā iegūtās zonas mirdzēs ar atšķirīgu gaismu. Tas ļauj reakciju vienā mēģenē vienlaicīgi veikt visiem nukleotīdiem un iegūtās ķēdes dalot pēc garuma, lai identificētu nukleotīdus pēc krāsas (sk. 11. att.).

Šādas metodes ļāva noteikt ne tikai atsevišķu gēnu secību, bet arī nolasīt veselus genomus. Tagad ir izstrādātas vēl ātrākas metodes nukleotīdu secības noteikšanai gēnos. Ja pāra cilvēka genomu atšifrēja liels starptautisks konsorcijs, izmantojot pirmo citēto metodi 12 gadu laikā, otrais, izmantojot otro, trīs gadu laikā, tagad to var izdarīt mēnesī. Tas ļauj prognozēt personas noslieci uz daudzām slimībām un jau iepriekš veikt pasākumus, lai no tām izvairītos.

Molekulārais biologs Ir pētnieks medicīnas jomā, kura misija ir ne vairāk, ne mazāk glābt cilvēci no bīstamām slimībām. Starp šādām slimībām, piemēram, onkoloģija, kas mūsdienās ir kļuvusi par vienu no galvenajiem nāves cēloņiem pasaulē, tikai nedaudz atpaliek no līdera - sirds un asinsvadu slimības. Jaunas onkoloģijas agrīnas diagnostikas, vēža profilakses un ārstēšanas metodes ir mūsdienu medicīnas prioritārs uzdevums. Molekulārie biologi onkoloģijas jomā izstrādā antivielas un rekombinantus (ģenētiski modificētus) proteīnus agrīnai diagnostikai vai mērķtiecīgai zāļu piegādei organismā. Šīs jomas eksperti izmanto jaunākos zinātnes un tehnikas sasniegumus, lai radītu jaunus organismus un organiskās vielas to turpmākai izmantošanai pētniecības un klīniskajās darbībās. Starp molekulāro biologu izmantotajām metodēm ir klonēšana, transfekcija, infekcija, polimerāzes ķēdes reakcija, gēnu sekvencēšana un citas. Viens no uzņēmumiem, kas interesējas par molekulārajiem biologiem Krievijā, ir PrimeBioMed LLC. Organizācija nodarbojas ar antivielu reaģentu ražošanu vēža diagnosticēšanai. Šādas antivielas galvenokārt izmanto, lai noteiktu audzēja veidu, tā izcelsmi un ļaundabīgo audzēju, tas ir, spēju metastizēt (izplatīties uz citām ķermeņa daļām). Antivielas tiek uzklātas uz pētāmajām audu sekcijām, pēc kurām tās šūnās saistās ar noteiktiem olbaltumvielām - marķieriem, kas atrodas audzēja šūnās, bet veselās šūnās to nav un otrādi. Atkarībā no pētījuma rezultātiem tiek nozīmēta turpmāka ārstēšana. Starp "PrimeBioMed" klientiem ir ne tikai medicīnas, bet arī zinātniskās institūcijas, jo antivielas var izmantot arī pētījumu problēmu risināšanai. Šādos gadījumos var izgatavot unikālas antivielas, kas var saistīties ar pētāmo proteīnu, veicot īpašu uzdevumu pēc īpaša pasūtījuma. Vēl viena daudzsološa uzņēmuma pētījumu joma ir mērķtiecīga (mērķtiecīga) narkotiku piegāde organismā. Šajā gadījumā antivielas tiek izmantotas kā transports: ar viņu palīdzību zāles tiek piegādātas tieši ietekmētajos orgānos. Tādējādi ārstēšana kļūst efektīvāka un tai ir mazāk negatīvu seku organismam nekā, piemēram, ķīmijterapijai, kas ietekmē ne tikai vēža šūnas, bet arī citas šūnas. Paredzams, ka molekulārā biologa profesija nākamajās desmitgadēs kļūs arvien pieprasītāka: palielinoties cilvēka vidējam dzīves ilgumam, pieaugs onkoloģisko slimību skaits. Agrīna audzēju diagnostika un inovatīva ārstēšana, izmantojot vielas, kuras ieguvuši molekulārie biologi, glābs dzīvības un uzlabos tā kvalitāti milzīgam skaitam cilvēku.

Profesionālā pamatizglītība

Procenti atspoguļo to speciālistu sadalījumu, kuriem ir noteikts izglītības līmenis darba tirgū. Galvenās specializācijas profesijas apgūšanai ir apzīmētas ar zaļu krāsu.

Spējas un prasmes

• Spēja rīkoties ar reaģentiem, paraugiem, jums jāprot strādāt ar maziem objektiem
• Prasmes darbam ar lielu informācijas daudzumu
• Spēja strādāt ar rokām

Intereses un vēlmes

• Vēlme uzzināt kaut ko jaunu
• Spēja strādāt vairākuzdevumu režīmā (jums vienlaikus jāuzrauga vairāku reakciju un procesu gaita)
• Precizitāte
• Atbildība (jūs nevarat atstāt darbu "rītdienai", jo paraugi var būt bojāti)
• Pārdomīgums
• Smags darbs
• Uzmanība (jums jāuzrauga mikroprocesi)

Profesija cilvēkiem

Marija Šitova

Daria Samoilova

Aleksejs Gračevs

Molekulārā bioloģija onkoloģijas jomā ir daudzsološs profesionāls virziens, jo cīņa pret vēzi ir viens no pasaules medicīnas prioritārajiem uzdevumiem.

Molekulārie biologi ir pieprasīti daudzās jomās, pateicoties aktīvai zinātnes, biotehnoloģisko un inovatīvi uzņēmumi... Mūsdienās trūkst speciālistu, īpaši tādu, kuriem ir noteikta pieredze viņu specialitātē. Līdz šim diezgan liels skaits absolventu turpina doties strādāt uz ārzemēm. Tagad Krievijā sāk parādīties efektīva darba iespējas biotehnoloģijas jomā, taču par masu mērogu vēl ir pāragri runāt.

Molekulārā biologa darbs ietver aktīvu speciālista līdzdalību zinātniskās aktivitātes, kas kļūst par karjeras izaugsmes mehānismu. Profesijas attīstība ir iespējama, piedaloties zinātniskos projektos un konferencēs, iespējams, attīstot saistītās zināšanu jomas. Nākotnē ir iespējama arī akadēmiskā attīstība no jaunākā pētnieka līdz vecākajam pētniekam līdz vadošajam pētniekam, profesoram un / vai katedras / laboratorijas vadītājam.

31.2

Draugiem!

atsauce

Molekulārā bioloģija no bioķīmijas izauga 1953. gada aprīlī. Tās izskats ir saistīts ar Džeimsa Vatsona un Fransisa Krika vārdiem, kuri atklāja DNS molekulas struktūru. Atklājums bija iespējams, pateicoties ģenētikas, baktēriju un vīrusu bioķīmijas pētījumiem. Molekulārā biologa profesija nav plaši izplatīta, taču šodien tās loma mūsdienu sabiedrībā ir ļoti liela. Lielam skaitam slimību, ieskaitot tās, kas izpaužas ģenētiskā līmenī, zinātniekiem ir jāmeklē risinājumi šai problēmai.

Darbību apraksts

Vīrusi un baktērijas pastāvīgi mutē, kas nozīmē, ka medikamenti pārstāj palīdzēt cilvēkam un slimības kļūst nekontrolējamas. Molekulārās bioloģijas uzdevums ir sasniegt šo procesu un izstrādāt jaunu ārstniecības līdzekli slimību ārstēšanai. Zinātnieki strādā saskaņā ar vispāratzītu shēmu: bloķē slimības cēloni, novērš iedzimtības mehānismus un tādējādi atvieglo pacienta stāvokli. Visā pasaulē ir vairāki centri, klīnikas un slimnīcas, kur molekulārie biologi izstrādā jaunus ārstēšanas veidus, lai palīdzētu pacientiem.

Darba pienākumi

Molekulārā biologa pienākumos ietilpst procesu izpēte šūnā (piemēram, izmaiņas DNS audzēju attīstības laikā). Tāpat eksperti pēta DNS iezīmes, to ietekmi uz visu organismu un atsevišķu šūnu. Šādi pētījumi tiek veikti, piemēram, pamatojoties uz PCR (polimerāzes ķēdes reakcija), kas ļauj analizēt ķermeni attiecībā uz infekcijām, iedzimtām slimībām un noteikt bioloģiskās attiecības.

Karjeras izaugsmes iezīmes

Molekulārā biologa profesija ir diezgan daudzsološa savā jomā, un šodien tā apgalvo, ka ir pirmā nākotnes medicīnas profesiju reitingā. Starp citu, molekulārajam biologam visu laiku nav jāpaliek šajā apgabalā. Ja ir vēlme mainīt nodarbošanos, viņš var pārkvalificēties kā laboratoriju aprīkojuma pārdošanas menedžeris, sākt attīstīt ierīces dažādiem pētījumiem vai atvērt savu biznesu.