Что такое центрифугирование в биологии. Центрифугирование: виды и применение метода
Центрифугирование
способ разделения неоднородных, дисперсных жидких систем в поле центробежных сил (центрифугатном поле). Обладает более высокой способностью к разделению, чем отжимание, отстаивание и фильтрование. Ц. осуществляют в центрифугах, принцип работы к-рых основан на создании центробежной силы, увеличивающей скорость разделения компонентов смеси по сравнению со скоростью их разделения только под влиянием силы тяжести. Эффективность центрифуги оценивают по «фактору разделения» К, к-рый рассчитывают по формуле: К= (2p n) 2 r/g, где n -число оборотов в мин; r-радиус вращения ротора;g - ускорение свободного падения. В практике чаще с этой целью применяют g, к-рое может быть найдено из вышеприведенной формулы или по формуле g=l,117 x l0 -5 N 2 r, где N-число оборотов; г- радиус. Центрифуги состоят из корпуса, двигателя, ротора, механизма передачи, рабочей камеры и панели управления. Гнезда для пробирок или стаканов для более быстрого разделения компонентов смеси располагают под углом (в угловых роторах) или они принимают такое положение при вращении горизонтального ротора. Различия в скоростях седиментации частиц смеси увеличиваются при увеличении плотности среды, в к-рой происходит разделение. В связи с этим иногда Ц. проводят в плотной среде, напр., в р-ре сахарозы. В микробиологии Ц. используют для осаждения микробов, освобождения микробной взвеси от грубых примесей, увеличения плотности микробов в ед. объема и для др. целей. В зависимости от массы микробов применяют различные типы центрифуг. В вирусологии и иммунологии обычно нужны центрифуги с высоким фактором разделения, т. н. супер- и ультрацентрифуги. Для осаждения бактерий лучше использовать центрифуги с фактором разделения около 7 тыс. (9-10 тыс. об/мин). Осаждение грибов, простейших, животных клеток, грубых примесей проводят на центрифугах с малым фактором разделения (1,5 -3 тыс. об/мин). При малых концентрациях процесс оседания частиц затягивается. Его можно ускорить добавлением коагулянта или, напр., убитых бактерий этого же вида. Процесс Ц. начинают с уравновешивания на специальных весах стаканов с содержащими жидкость пробирками, располагающимися в роторе друг против друга. На дно стаканов следует поместить резиновые прокладки. Перед Ц. крышку центрифуги плотно закрывают, включают двигатель, скорость оборотов ротора постепенно увеличивают, доводя до заданной. По истечении времени Ц. двигатель выключают, крышку открывают после полной остановки ротора. При Ц. живых микробов необходимо строго соблюдать правила асептики и техники безопасности. Ц. взвесей, содержащих микробы, лучше проводить в стеклянных или др. надежно стерилизующихся пробирках. Ватную пробку следует обогнуть вокруг края пробирки или стакана и прижать резиновым кольцом. Использование металлических колпачков допустимо только при малых скоростях вращения. Пробирки не следует наполнять более чем на 1 см. от края. Применять для Ц. обычные пробирки или бутылки нельзя. См. улътрацентрифуга.
(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)
- - Рис. 1. Центрифуги. Рис. 1. Центрифуги:1 лабораторная настольная ЦЛН-2;2 лабораторная рефрижераторная ЦЛР-1...
Ветеринарный энциклопедический словарь
- - разделение в поле центробежных сил жидких дисперсных систем с частицами размером более 100 нм. Используют для выделения составляющих фаз из двухкомпонентных и трехкомпонентных систем. Методы и аппаратура...
Химическая энциклопедия
- - разделение неоднородных систем с помощью центробежных сил; применяется для разделения суспензий, осветления загрязнённых жидкостей, классификации шламов по крупности твёрдых частиц и т.д....
Термины атомной энергетики
- - density gradient centrifugation - ...
- - sucrose equilibrium density gradient centrifugation - .Метод разделения макромолекул на основании их коэффициента седиментации
: разделяемая смесь наносится на поверхность раствора с градиентом концентрации сахарозы <... Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь
- - cesium chloride equilibrium density gradient centrifugation - .Mетод центрифугирования в градиенте плотности
Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь - - разделение неоднородных смесей на составные части различной плотности с помощью центрифуги...
Большой медицинский словарь
- - способ бетонирования в стальных формах отдельных железобетонных изделий с использованием эффекта центробежной силы, создаваемой центрифугой при большой частоте вращения...
Центрифугирование - разделение неоднородных систем (напр., жидкость - твердые частицы) на фракции по плотности при помощи центробежных сил. Приборы, применяемые для этой цели, называют центрифугами. Основной частью центрифуги является ротор с монтированными в нем гнездами для центрифужных пробирок. Ротор вращается с большой скоростью, вследствие чего создаются значительные по величине центробежные силы, под действием которых происходит разделение механических смесей, например осаждение взвешенных в жидкости частиц.
Центрифугирование применяется для отделения осадка от раствора, для отделения загрязненных жидкостей, производится также центрифугирование эмульсий (напр., сепарирование молока). Центрифугирование бетона применяется для увеличения его прочности. В клинических и санитарно-гигиенических лабораториях центрифугирование используют для отделения эритроцитовот плазмы крови,сгустков кровиотсыворотки, плотных частиц от жидкой части мочи и т. д.
Конструктивные особенности центрифуг заключаются в способе крепления к валу барабана и в пространственном его расположении. Все конструкции должны обеспечить, прежде всего, хорошую устойчивость ротора центрифуги. Поскольку вал приводит во вращение большую массу, он должен быть особенно устойчивым. Скорость вращения вала не должна равняться его критической скорости вращения, а должна быть больше или меньше ее. В первом случае вал называют гибким, во втором жёстким.
Препаративное центрифугирование - проводят с целью получения определенных компонентов из биологического материала для дальнейшего биохимического анализа. Такими компонентами могут быть клетки, их органеллы (митохондрии, рибосомы, ядра и др.) и макромолекулы (белки, ДНК и др.).
Аналитическое центрифугирование - проводят для выявления характеристик однородного материала, например, макромолекул. Материал центрифугируют, вследствие чего под контролем оптических систем происходит осаждение частиц. При этом можно определить их однородность, молекулярную массу, структуру, так как форма и масса частиц оказывают влияние на скорость осаждения. Проводя расчеты по стандартным формулам, можно вычислить эти параметры и составить характеристики исследуемого материала.
Ультрацентрифуга - прибор для разделения частиц размером менее 100 нм (коллоидов, субклеточных частиц, макромолекул белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов, синтетических полимеров и пр.), взвешенных или растворенных в жидкости. Это достигается вращением ротора, создающего центробежное поле с ускорением, на много порядков превышающим ускорение силы тяжести.
Аналитическое ультрацентрифугирование используют для исследования гомогенности (чистоты) препаратов биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов), а также для определения констант седиментации, молекулярной массы, констант ассоциации и размеров макромолекул. Ультрацентрифугирование применяется в медицине при клинической диагностике, для приготовления кровезаменителей и т.п.
Метод центрифугирования основан на различном поведении частиц в центробежном поле, создаваемом центрифугой. Образец, находящийся в сосуде для центрифугирования, помещают в ротор, который приводится в движение приводом центрифуги. Для разделения смеси частиц необходимо выбрать набор условий, таких как скорость вращения, время центрифугирования и радиус ротора. Для сферических частиц скорость осаждения (седиментации) зависит не только от ускорения, но и от радиуса и плотности частиц, а так же от вязкости среды, в которой производится осаждение образца.
Центрифугирование можно разделить на два вида: препаративное и аналитическое. Препаративное центрифугирование используется в случае, когда необходимо выделить часть образца для дальнейших исследований. Этот метод применяется для выделения клеток из суспензии, биологических макромолекул и т.д.
Аналитическое центрифугирование применяется для изучения поведения биологических макромолекул в центробежном поле. Данный метод позволяет получать данные о массе, форме и размерах молекул, находящихся в относительно небольших объемах образца. В повседневной практике работы в лаборатории чаще всего встречается препаративное центрифугирование.
Препаративные лабораторные центрифуги , в свою очередь, подразделяются на группы по назначению: препаративные ультрацентрифуги, центрифуги общего назначения и скоростные центрифуги. Центрифуги общего назначения имеют самое большое практическое применение в медицинских лабораториях, имеют максимальную скорость до 6 тысяч об/мин. Основной особенностью данного вида приборов является их относительно большая емкость – до 6 литров, что позволяет использовать для центрифугирования не только центрифужные пробирки объемом до 100 мл, но и емкости до 1.25 литра. Во всех центрифугах общего назначения роторы жестко крепятся на валу привода, поэтому центрифугируемые емкость должны быть довольно точно уравновешены. Чтобы избежать поломки, не следует загружать в ротор нечетное количество пробирок, при неполной загрузке емкость следует размещать друг напротив друга.
Скоростные центрифуги имеют предельную скорость 25 тыс. об/мин и ускорение до 89 тыс g. Камеру, в которой находится ротор и центрифугирумеые образцы, оснащают системой охлаждения для предотвращения нагревания, возникающего от трения при вращении ротора на больших скоростях. Обычно, такие центрифуги могут работать с объемом до 1.5 литра и оснащаются угловыми роторами или роторами со сменными стаканами.
Препаративные ультрацентрифуги разгоняются до 75000 об/мин и имеют максимальное центробежное ускорение 510 тыс g. Их оснащают холодильной и вакуумной установками, для предотвращения перегрева ротора от трения о воздух. Роторы для этих центрифуг изготавливают из высокопрочных титановых или алюминиевых сплавов. Вал ультрацентрифуг, в отличие от скоростных и препаративных, делается гибким для уменьшения вибрации при нарушении равновесия ротора. Емкости в роторе должны быть тщательно уравновешены с точностью до одной десятой грамма.
Препаративное центрифугирование – один из методов выделения биологического материала для последующего проведения биохимических исследований. Позволяет выделить значительное количество клеточных частиц для комплексного изучения их биологической активности, структуры и морфологии. Также метод применим для выделения основных биологических макромолекул. Сфера использования: медицинские, химические и биохимические исследования.
Классификация методов препаративного центрифугирования
Препаративное центрифугирование осуществляется по одной из следующих методик:
|
- Изопикническое. Может проводиться в градиенте плотности либо обычным путем. В первом случае обрабатываемый материал наслаивается на поверхность буферного раствора с непрерывным градиентом плотности и центрифугируется до разделения частиц по зонам. Во втором случае исследуемая среда центрифугируется до образования осадка из частиц с большим молекулярным весом, после чего из полученного остатка выделяются исследуемые частицы.
- Равновесное. Проводится в градиенте плотности из солей тяжелых металлов. Центрифугирование позволяет установить равновесное распределение концентрации растворенного исследуемого вещества. Затем под воздействием сил центробежного ускорения частицы среды собираются в отдельной зоне пробирки.
Оптимальная методика подбирается с учетом поставленных целей и особенностей исследуемой среды.
Классификация препаративных лабораторных центрифуг
В зависимости от особенностей конструкции и эксплуатационных характеристик препаративные центрифуги можно разделить на 3 основные группы:
 |
|
- Скоростные. Максимальная скорость – 25.000 об/мин при относительном центробежном ускорении до 89.000 g. Для предотвращения нагревания из-за возникающих при вращении ротора сил трения рабочая камера оснащается системой охлаждения. Комплектуются угловыми роторами либо роторами с подвесными контейнерами для размещения биологического материала. Емкость скоростных препаративных
центрифуг – 1.5 дм 3 . - Ультрацентрифуги. Максимальная скорость – 75.000 об/мин при относительном центробежном ускорении до 510.000g. Для предотвращения нагревания из-за возникающих при вращении ротора сил трения оснащаются системой охлаждения и вакуумной установкой. Роторы ультрацентрифуг изготавливается из сверхпрочных титановых либо алюминиевых сплавов. Для уменьшения вибраций из-за неравномерного заполнения ротора имеют гибкий вал.
К отдельной категории следует отнести препаративные центрифуги специального исполнения, предназначенные для проведения определенных разновидностей исследований и решения специфических задач. В эту группу входят центрифуги с нагревательной рубашкой, рефрижераторные центрифуги и другое подобное оборудование.
Особенности конструкции ротора в препаративных центрифугах
Препаративные центрифуги комплектуются угловыми либо горизонтальными роторами:
 |
|
Тип ротора определяет сферу использования оборудования. Возможность смены ротора позволяет использовать одну и ту же модель центрифуги для решения разноплановых задач. Медицинские центрифуги для лаборатории Centurion выпускаются в напольных либо настольных вариантах исполнения, что делает возможным использование оборудования в любых помещениях вне зависимости от доступной площади.
Курсовая работа
Центрифугирование
1. Принцип метода
Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле. Суспензию частиц, помещенную в пробирку, загружают в ротор, установленный на валу привода центрифуги.
В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью. Скорость седиментации зависит от центробежного ускорения , прямо пропорционального угловой скорости ротора и расстоянию между частицей и осью вращения:
а центробежное ускорение тогда будет равно)
Поскольку один оборот ротора составляет 2п радиан, угловую скорость ротора в оборотах в минуту можно записать так:
Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g и называется относительное центробежное ускорение , т. е.
или
При перечислении условий разделения частиц указывают скорость вращения и радиус ротора, а также время центрифугирования. Центробежное ускорение обычно выражают в единицах g , рассчитанных из среднего радиуса вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке. На основании уравнения Доулом и Котциасом была составлена номограмма, выражающая зависимость ОЦУ от скорости вращения ротора и радиуса г.
Рис. 2 .1. Номограмма для расчета центробежного ускорения.
Для определения О соединяют прямой линией значения радиуса и скорости вращения ротора на крайних шкалах; точка пересечения этой прямой со средней шкалой дает искомую величину центробежного ускорения. Следует иметь в виду, что правая колонка цифр шкалы О соответствует правой колонке цифр шкалы скорости вращения ротора; левая - левой.
Скорость седиментации сферических частиц зависит не только от центробежного ускорения, но и от плотности и радиуса самих частиц и от вязкости среды суспендирования. Время, необходимое для осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жидкости до дна центрифужной пробирки, обратно пропорционально скорости седиментации и определяется следующим уравнением:
где t - время седиментации в секундах, rj - вязкость среды, г ч - радиус частицы, р ч - плотность частицы, р - плотность среды, г м - расстояние от оси вращения до мениска жидкости, г д - расстояние от оси вращения до дна пробирки.
Как следует из уравнения, при заданной скорости вращения ротора время, необходимое для осаждения гомогенных сферических частиц, обратно пропорционально квадрату их радиусов и разности плотностей частиц и среды и прямо пропорционально вязкости среды. Поэтому смесь гетерогенных, приблизительно сферических частиц, различающихся по плотности и размерам, можно разделить либо за счет разного времени осаждения их на дно пробирки при данном ускорении, либо за счет распределения седиментирующих частиц вдоль пробирки, устанавливающегося через определенный промежуток времени. При разделении веществ необходимо учитывать и такие важные факторы, как плотность и вязкость среды. Описанными методами можно разделять клеточные органеллы из гомогенатов тканей. Основные компоненты клетки осаждаются в следующей последовательности: сначала целые клетки и их фрагменты, затем ядра, хлоропласты, митохондрии, лизосомы, микросомы и, наконец, рибосомы. Осаждение несферических частиц не подчиняется уравнению, поэтому частицы одинаковой массы, но различной формы осаждаются при разных скоростях. Эта особенность используется при исследовании с помощью ультрацентрифугирования конформации макромолекул.
заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследований. При этом можно брать большие количества исходного биологического материала, например посевы микробных клеток из периодических или непрерывных культур, а также посевы растительных и животных клеток из культур ткани и плазмы крови. С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности. Метод применяется также для выделения таких биологических макромолекул, как ДНК и белки из предварительно очищенных препаратов.
Аналитическое центрифугирование применяется главным образом для изучения чистых или практически чистых препаратов макромолекул или частиц, например рибосом. В данном случае используется небольшое количество материала, а седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярном весе и структуре материала. В практикумах для студентов препаративное центрифугирование применяется гораздо чаще, чем аналитическое, поэтому мы остановимся на нем более подробно, хотя в основе обоих методов лежат общие принципы.
2. Препаративное центрифугирование
2 .1 Дифференциальное центрифугирование
Этот метод основан на различиях в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал, например гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. К сожалению, получить абсолютно чистый осадок практически невозможно; чтобы понять, почему это происходит, обратимся к рассмотрению процесса, происходящего в центрифужной пробирке в начале каждой стадии центрифугирования.
Сначала все частицы гомогената распределены по объему центрифужной пробирки равномерно, поэтому получить чистые препараты осадков самых тяжелых частиц за один цикл центрифугирования невозможно: первый образовавшийся осадок содержит в основном самые тяжелые частицы, но, кроме этого, также некоторое количество всех исходных компонентов. Получить достаточно чистый препарат тяжелых частиц можно лишь при повторном суспендировании и центрифугировании исходного осадка. Дальнейшее центрифугирование супернатанта при последующем увеличении центробежного ускорения приводит к седиментации частиц средних размеров и плотности, а затем и к осаждению самых мелких частиц, имеющих наименьшую плотность. На рис. 2.3 изображена схема фракционирования гомогената печени крысы.
Рис. 2.2. Дифференциальное центрифугирование суспензии частиц в центробежном поле.
Сначала частицы распределены по всему объему центрифужной пробирки равномерно (а): в ходе центрифугирования частицы седиментируют в соответствии с их размерами и формой (б - д).
Рис. 2.3. Схема фракционирования гомогената печени крысы на субклеточные фракции.
Дифференциальное центрифугирование является, по-видимому, самым распространенным методом выделения клеточных органелл из гомогенатов тканей. Наиболее успешно применяется этот метод для разделения таких клеточных органелл, которые значительно отличаются друг от друга по размерам и плотности. Но даже и в этом случае получаемые фракции никогда не бывают абсолютно гомогенными, и для их дальнейшего разделения применяют другие методы, описанные ниже. Эти методы, основанные на различиях в плотности органелл, обеспечивают более эффективное разделение благодаря тому, что центрифугирование осуществляют в растворах с непрерывным или ступенчатым градиентом плотности. Недостатком этих методов является то, что приходится тратить время на получение градиента плотности раствора.
2.2 Зонально-скоростное центрифугирование
Метод зонально-скоростного, или, как его еще называют, s -зонального центрифугирования, заключается в наслаивании исследуемого образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности. Затем образец центрифугируют до тех пор, пока частицы не распределятся вдоль градиента в виде дискретных зон или полос. Благодаря созданию градиента плотности удается избежать смешивания зон, возникающего в результате конвекции. Метод зонально-скоростного центрифугирования применяется для разделения гибридов РНК-ДНК, субъединиц рибосом и других клеточных компонентов.
Рис. 2 .4. Скоростное и изопикническое разделение частиц в градиенте плотности. Перед началом центрифугирования суспензию частиц наслаивают поверх градиента плотности жидкости (а). При скоростном центрифугировании частицы не достигают изопикническое точки, а при изопикническом разделении центрифугирование продолжают до тех пор, пока исследуемые частицы ие достигнут зоны с соответствующей плотностью (б).
2.3 Изопикническое центрифугирование
Изопикническое центрифугирование проводят как в градиенте плотности, так и обычным путем. Если центрифугирование проводится не в градиенте плотности, препарат сначала центрифугируют так, чтобы осели частицы, молекулярный вес которых больше, чем у исследуемых частиц. Эти тяжелые частицы отбрасывают, и образец суспендируют в среде, плотность которой такая же, как и у фракции, которую хотят выделить, а затем центрифугируют до тех пор, пока исследуемые частицы не осядут на дно пробирки, а частицы меньшей плотности не всплывут на поверхность жидкости..
Рис. 2.5. Изопикническое разделение без градиента плотности.
Перед центрифугированием частицы распределены по объему центрифужной пробирки равномерно (а). После центрифугирования более легкие частицы всплывают наверх, в то время как тяжелые оседают на дно пробирки (б)
Другой способ заключается в наслаивании образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности, охватывающим диапазон плотностей всех компонентов смеси. Центрифугирование проводят до тех пор, пока плавучая плотность частиц не сравняется с плотностью соответствующих зон, т. е. пока не произойдет разделение частиц по зонам. Метод получил название зонально-изопикнического, или резонального центрифугирования, так как основным моментом здесь является плавучая плотность, а не размеры или форма частиц. На величину плотности, при которой частицы образуют изопикнические полосы, влияет природа среды суспендирования; частицы могут быть проницаемыми для одних соединений, находящихся в растворе, и непроницаемыми для других или же присоединять молекулы раствора. При использовании зонального ротора митохондрии, лизосомы, пероксисомы и микросомы концентрируются в полосах с 42%, 47%, 47% и 27%-ной сахарозой, соответствующих плотности 1,18, 1,21, 1,21 и 1,10 г-см -3 соответственно. Плотность субклеточных органелл зависит также и от избирательного поглощения ими определенных соединений. Введение крысам не вызывающего гемолиз детергента тритона WR -1339 приводит ^увеличению размеров и уменьшению плотности лизосом печени; плотность митохондрий и пероксисом остается без изменений. Несмотря на то что седиментационные свойства лизосом при этом, как правило, не меняются, их равновесная плотность в градиенте сахарозы понижается с 1,21 до 1,1, что приводит к соответствующему разделению лизосомально-пероксисомальной фракции. Эта особенность используется при количественном разделении лизосом, митохондрий и пероксисом, основанном на удалении из гомогенной среды всех частиц с большей, чем у микросом, плотностью и последующем изопикническом центрифугировании выпавших в осадок тяжелых частиц.
2.4 Равновесное центрифугирование в градиенте плотности
Для создания градиента плотности используют соли тяжелых металлов, например рубидия или цезия, а также растворы сахарозы. Образец, например, ДНК, смешивают с концентрированным раствором хлористого цезия. И растворенное вещество, и растворитель сначала распределяются по всему объему равномерно. В ходе центрифугирования устанавливается равновесное распределение концентрации, а следовательно, и плотности CsCl , так как ионы цезия обладают большой массой. Под действием центробежного ускорения молекулы ДНК перераспределяются, собираясь в виде отдельной зоны в части пробирки с соответствующей им плотностью. Метод применяется главным образом в аналитическом центрифугировании и был использован Мезельсоном и Сталем для изучения механизма репликации ДНК Е. coli . Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является также одним из методов разделения и изучения липопротеидов плазмы крови человека.
2. 5 Формирование и извлечение градиентов
2.5.1 Природа градиентов
Для создания градиентов плотности растворов чаще всего применяются растворы сахарозы, иногда с фиксированным рН. В некоторых случаях хорошее разделение получается при использовании вместо обычной воды D 2 0. В табл. 2.1 приведены свойства некоторых растворов сахарозы.
Концентрация, %
Свойства растворов сахарозы
Выбор градиента диктуется конкретными задачами фракционирования. Так, например, фикол, выпускаемый фирмой Pharmacia Fine Chemicals , может заменять сахарозу в тех случаях, когда необходимо создать градиенты с большой плотностью и низким осмотическим давлением. Еще одно преимущество фикола состоит в том, что он не проходит через клеточные мембраны. Для создания градиентов большей плотности применяют соли тяжелых металлов, например рубидия и цезия, однако из-за коррозирующего действия CsCl такие градиенты используются только в роторах, изготовленных из стойких металлов, например титана»
2.5.2 Методика создания ступенчатого градиента плотности
Для создания градиента плотности в центрифужную пробирку осторожно вносят при помощи пипетки несколько растворов с последовательно уменьшающейся плотностью. Затем на самый верхний слой, имеющий наименьшую плотность, наслаивают образец в виде узкой зоны, после чего пробирку центрифугируют. Получить плавные линейные градиенты можно за счет сглаживания ступенчатых градиентов при длительном стоянии раствора. Процесс можно ускорить, осторожно перемешивая содержимое пробирки проволокой или слегка покачивая пробирку.
2.5.3 Методика создания плавного градиента плотности
В большинстве случаев для создания плавного градиента плотности пользуются специальным устройством. Оно состоит из двух цилиндрических сосудов строго определенного одинакового диаметра, сообщающихся друг с другом в нижней части с помощью стеклянной трубки с контрольным клапаном, что позволяет регулировать пропорции, в которых смешивается содержимое обоих сосудов. Один из них снабжен мешалкой и имеет выходное отверстие, через которое раствор стекает в центрифужные пробирки. Более плотный раствор помещают в смеситель; второй цилиндр заполняют раствором меньшей плотности. Высота столбика растворов в обоих цилиндрах устанавливается таким образом, чтобы гидростатическое давление в них было одинаковым. Более плотный раствор постепенно выпускается из смесителя в центрифужные пробирки и одновременно замещается равным объемом раствора меньшей плотности, поступающего в смеситель из второго цилиндра через контрольный клапан. Гомогенность раствора в смесителе обеспечивается за счет постоянного перемешивания раствора с помощью мешалки. По мере сливания раствора в центрифужные пробирки плотность его уменьшается и в пробирках создается линейный градиент плотности. Нелинейные градиенты можно создавать при помощи системы, состоящей из двух цилиндров неодинакового диаметра.
Для формирования градиентов плотности различной крутизны пользуются системой из двух механически управляемых шприцов, которые заполняют растворами неодинаковой плотности. Различные градиенты можно создавать, изменяя относительную скорость движения поршней.
2.5.4 Извлечение градиентов из центрифужных пробирок
После завершения центрифугирования и разделения частиц необходимо извлечь образовавшиеся зоны. Это делают несколькими способами, чаще всего методом вытеснения. Центрифужную пробирку прокалывают у основания и в нижнюю ее часть медленно вводят очень плотную среду, например 60-70%-ный раствор сахарозы. Находящийся сверху раствор вытесняется, и фракции отбирают при помощи шприца, пипетки или специального приспособления, соединенного через трубочку с коллектором фракций. Если пробирки изготовлены из целлулоида или нитроцеллюлозы, фракции извлекают, надрезав пробирку специальным лезвием. Для этого центрифужную пробирку, закрепленную в штативе, надрезают непосредственно под нужной зоной и отсасывают фракцию шприцом или пипеткой. При подходящей конструкции режущего устройства потеря раствора будет минимальной. Сбор фракций осуществляют также, проколов основание пробирки тонкой полой иглой. Капли, вытекающие из пробирки через иглу, собирают в коллектор фракций для дальнейшего анализа.
2.5.5 Препаративные центрифуги и их применение
Препаративные центрифуги можно подразделить на три основные группы: центрифуги общего назначения, скоростные центрифуги и препаративные ультрацентрифуги. Центрифуги общего назначения дают максимальную скорость 6000 об мин -1 и ОЦУ до 6000 g . Они отличаются друг от друга только емкостью и имеют ряд сменных роторов: угловых и с подвесными стаканами. Одной из особенностей этого вида центрифуг является их большая емкость - от 4 до 6 дм 3 , что позволяет загружать их не только центрифужными пробирками на 10,50 и 100 см 3 , но и сосудами емкостью до 1,25 дм 3 . Во всех центрифугах этого типа роторы жестко крепятся на валу привода, и центрифужные пробирки вместе с их содержимым должны быть тщательно уравновешены и различаться по весу не более чем на 0,25 г. Нельзя загружать в ротор нечетное число пробирок, а при неполной загрузке ротора пробирки следует размещать симметрично, одна против другой, обеспечивая таким образом равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора.
Скоростные центрифуги дают предельную скорость 25 000 об-мин -1 и ОЦУ до 89000 g . Камера ротора снабжена системой охлаждения, предотвращающей нагревание, которое возникает вследствие трения при вращении ротора. Как правило, скоростные центрифуги имеют емкость 1,5 дм 3 и снабжены сменными роторами, как угловыми, так и с подвесными стаканами.
Препаративные ультрацентрифуги дают предельную скорость до 75000 об-мин -1 и максимальное центробежное ускорение 510 000 g . Они снабжены как холодильником, так и вакуумной установкой, чтобы предотвратить перегрев ротора вследствие трения его о воздух. Роторы таких центрифуг изготавливают из высокопрочных алюминиевых или титановых сплавов. В основном применяют роторы из алюминиевых сплавов, однако в тех случаях, когда необходимы особенно высокие скорости, пользуются роторами из титана. Для уменьшения вибрации, возникающей в результате нарушения равновесия ротора из-за неравномерного наполнения центрифужных пробирок, ультрацентрифуги имеют гибкий вал. Центрифужные пробирки и их содержимое должны быть тщательно уравновешены с точностью до 0,1 г. Аналогичные требования следует соблюдать и при загрузке роторов центрифуг общего назначения.
2.6 Конструкция роторов
2.6.1 Угловые роторы и роторы с подвесными стаканами
Роторы препаративных центрифуг обычно бывают двух типов - угловые и с подвесными стаканами. Угловыми они называются потому, что помещаемые в них центрифужные пробирки все время находятся под определенным углом к оси вращения. В роторах с подвесными стаканами пробирки устанавливаются вертикально, а при вращении под действием возникающей центробежной силы переходят в горизонтальное положение; угол наклона к оси вращения составляет 90°.
В угловых роторах расстояние, проходимое частицами до соответствующей стенки пробирки, весьма невелико, и поэтому седиментация происходит сравнительно быстро. После столкновения со стенками пробирки частицы соскальзывают вниз и образуют на дне осадок. При центрифугировании возникают конвекционные потоки, которые в значительной степени затрудняют разделение частиц с близкими седиментационными свойствами. Тем не менее роторы подобной конструкции с успехом применяются для разделения частиц, скорости седиментации которых различаются довольно сильно.
В роторах с подвесными стаканами также наблюдаются конвекционные явления, однако выражены они не так сильно. Конвекция является результатом того, что под действием центробежного ускорения частицы оседают в направлении, не строго перпендикулярном оси вращения, и поэтому, как и в угловых роторах, ударяются о стенки пробирки и соскальзывают на дно.
Конвекционных явлений и эффектов завихрения удается до некоторой степени избежать, используя пробирки секториальной формы в роторах с подвесными стаканами и регулируя скорость вращения ротора; перечисленных выше, недостатков лишен также метод центрифугирования в градиенте плотности.
2.6.2 Роторы непрерывного действия
Роторы непрерывного действия предназначены для скоростного фракционирования относительно небольших количеств твердого материала из суспензий больших объемов, например для выделения клеток из питательных сред. В ходе центрифугирования суспензия частиц добавляется в ротор непрерывно; пропускная способность ротора зависит от природы осаждаемого препарата и варьируете пределах от 100 см 3 до 1 дм 3 в 1 мин. Особенность ротора состоит в том, что он представляет собой изолированную камеру специальной конструкции; содержимое ее не сообщается с внешней средой, а поэтому не загрязняется и не распыляется.
2.6.3 Зональные роторы, или роторы Андерсона
Рис. 2 .6. Стадии центрифугирования (а- е) в зональном роторе
Зональные роторы делают из алюминиевых или титановых сплавов, которые способны выдерживать весьма значительные центробежные ускорения. Обычно в них имеется цилиндрическая полость, закрывающаяся съемной крышкой. Внутри полости, на оси вращения расположена осевая трубка, на которую надевается насадка с лопастями, разделяющими полость ротора на четыре сектора. Лопасти или перегородки имеют радиальные каналы, по которым из осевой трубки к периферии ротора нагнетается градиент. Благодаря такой конструкции лопастей конвекция сведена до минимума.
Заполнение ротора производится при его вращении со скоростью около 3000 об/мин -1 . В ротор нагнетают заранее созданный градиент, начиная со слоя наименьшей плотности, который равномерно распределяется по периферии ротора и удерживается у внешней его стенки перпендикулярно оси вращения благодаря центробежной силе . При последующем добавлении слоев градиента большей плотности происходит непрерывное смещение к центру менее плотных слоев. После того как в ротор будет нагнетен весь градиент, его заполняют до полного объема раствором, называемым «подушкой», плотность которого совпадает или несколько превышает наибольшую плотность преформированного градиента.
Затем через осевую трубку, наслаивают исследуемый образец , который вытесняют из трубки в объем ротора с помощью раствора меньшей плотности , при этом с периферии удаляется такой же объем «подушки». После всех этих процедур скорость вращения ротора доводят до рабочей и в течение необходимого промежутка времени проводят либо зонально-скоростное, либо зонально-изопикническое фракционирование . Извлечение фракций проводят при скорости вращения ротора 3000 об — мин -1 . Содержимое ротора вытесняют путем добавления с периферии «подушки», в первую очередь вытесняются менее плотные слои . Благодаря особой конструкции осевого канала ротора Андерсона смешивания зон при их вытеснении не происходит. Выходящий градиент пропускают через регистрирующее устройство, например ячейку спектрофотометра, с помощью которого по поглощению при 280 нм можно определить содержание белка, или через специальный детектор радиоактивности, после чего собирают фракции.
Емкость зональных роторов, используемых при средних скоростях, варьирует от 650 до 1600 см 3 , что позволяет получать довольно большое количество материала. Зональные роторы применяются для удаления белковых примесей из различных препаратов и для выделения и очистки митохондрий, лизосом, полисом и белков.
2.6.4 Анализ субклеточных фракций
Свойства полученного при фракционировании препарата субклеточных частиц можно отнести к свойствам самих частиц только в том случае, если препарат не содержит примесей. Следовательно, всегда необходимо оценивать чистоту получаемых препаратов. Эффективность гомогенизации и наличие в препарате примесей можно определить с помощью микроскопического исследования. Однако отсутствие видимых примесей еще не является достоверным доказательством чистоты препарата. Для количественной оценки чистоты полученный препарат подвергают химическому анализу, который позволяет установить содержание в нем белков или ДНК, определить его ферментативную активность, если возможно, и иммунологические свойства.
Анализ распределения ферментов во фракционируемых тканях основан на двух общих принципах. Первый из них заключается в том, что все частицы данной субклеточной популяции содержат одинаковый набор ферментов. Второй предполагает, что каждый фермент локализован в каком-то определенном месте внутри клетки. Если бы это положение было верно, то ферменты могли бы выступать в роли маркеров для соответствующих органелл: например, цито-хромоксидаза и моноаминооксидаза служили бы ферментами-маркерами митохондрий, кислые гидролазы - маркерами лизосом, каталаза - маркером пероксисом, а глюкозо-6-фосфатаза - маркером мембран микросом. Оказалось, однако, что некоторые ферменты, например малатдегидрогеназа, Р -глюкуронидаза, НАДФ’ Н-цитохром-с-редуктаза, локализованы более чем в одной фракции. Поэтому к выбору ферментов-маркеров субклеточных фракций в каждом конкретном случае следует подходить с большой осторожностью. Более того, отсутствие фермента-маркера еще не означает отсутствия соответствующих органелл. Вполне вероятно, что при фракционировании происходит потеря фермента органеллами или он ингибируется или инактивируется; поэтому для каждой фракции обычно определяют не менее двух ферментов-маркеров.
Фракция
2.7 Фракционирование методом дифференциального центрифугирования
2.7.1 Оформление результатов
Результаты, полученные при фракционировании тканей, удобнее всего оформлять в виде графиков. Так, при исследовании распределения ферментов в тканях данные лучше всего представлять в виде гистограмм, дающих возможность визуально оценить результаты проведенных экспериментов.
Ферментативную активности содержание белка в пробе определяют как в исходном гомогенате, так и в каждой выделенной субклеточной фракции в отдельности. Суммарная ферментативная активность и содержание белка во фракциях не должны сильно отличаться от соответствующих значений в исходном гомогенате.
Затем проводят расчет ферментативной активности и содержания белка в каждой фракции в % от общего выхода, на основании чего составляют гистограмму. По оси абсцисс последовательно откладывают относительное количество_ белка в каждой фракции в порядке их выделения, а по оси ординат - относительную удельную активность каждой фракции. Таким образом, по площади столбиков определяют ферментативную активность каждой фракции.
2.7.2 Аналитическое ультрацентрифугирование
В отличие от препаративного центрифугирования, целью которого является разделение веществ и их очистка, аналитическое ультрацентрифугирование применяется в основном для изучения седиментационных свойств биологических макромолекул и других структур. Поэтому в аналитическом центрифугировании применяют роторы и регистрирующие системы особой конструкции: они позволяют непрерывно наблюдать за седиментацией материала в центробежном поле.
Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 70 000 об-мин -1 , создавая при этом центробежное ускорение до 500 000 g . Ротор у них, как правило, имеет форму эллипсоида и соединен посредством струны с мотором, что позволяет варьировать скорость вращения ротора. Вращается ротор в вакуумной камере, снабженной холодильным устройством, и имеет две ячейки, аналитическую и балансировочную, которые устанавливаются в центрифуге строго вертикально, параллельно оси вращения. Балансировочная ячейка служит для уравновешивания аналитической и представляет собой металлический блок с прецизионной системой. В ней имеются также два индексных отверстия, находящиеся на строго определенном расстоянии от оси вращения, с помощью которых определяют соответствующие расстояния в аналитической ячейке. Аналитическая ячейка, емкость которой, как правило, равна 1 см 3 , имеет секториальную форму. При правильной установке в роторе она, несмотря на то что стоит вертикально, работает по тому же принципу, что и ротор с подвесными стаканами, создавая почти идеальные условия седиментации. На торцах аналитической ячейки имеются окошки с кварцевыми стеклами. Аналитические ультрацентрифуги снабжены оптическими системами, позволяющими наблюдать за седиментацией частиц в течение всего периода центрифугирования. Через заданные промежутки времени седиментирующий материал можно фотографировать. При фракционировании белков и ДНК за седиментацией наблюдают по поглощению в ультрафиолете, а в тех случаях, когда исследуемые растворы имеют разные коэффициенты преломления - с помощью шлирен-системы или интерференционной системы Рэлея. Два последних метода основаны на том, что при прохождении света через прозрачный раствор, состоящий из зон с различной плотностью, на границе зон происходит преломление света. При седиментации между зонами с тяжелыми и легкими частицами образуется граница, которая действует как преломляющая линза; при этом на фотопластинке, использующейся в качестве детектора, появляется пик. В ходе седиментации происходит перемещение границы, а следовательно, и пика, по скорости передвижения которого можно судить о скорости седиментации материала. Интерферометрические системы отличаются большей чувствительностью, чем шлирен-системы. Аналитические ячейки бывают односекторные, которые применяются наиболее часто, и двухсекторные, которые используются для сравнительного изучения растворителя и растворенного вещества.
В биологии аналитическое ультрацентрифугирование применяется для определения молекулярных весов макромолекул, проверки чистоты получаемых образцов, а также для исследования конформационных изменений в макромолекулах.
2.8 Применение аналитического ультрацентрифугирования
2.8.1 Определение молекулярных весов
Существует три основных метода определения молекулярных весов при помощи аналитического ультрацентрифугирования: определение скорости седиментации, метод седиментациоиного равновесия и метод приближения к седиментационному равновесию.
Определение молекулярного веса по скорости седиментации - это наиболее распространенный метод. Центрифугирование проводят при больших скоростях, так что частицы, вначале равномерно распределенные по всему объему, начинают упорядочение перемещаться по радиусу от центра вращения. Между областью растворителя, уже свободной от частиц, и той его частью, которая их содержит, образуется четкая граница раздела. Эта граница при центрифугировании перемещается, что дает возможность определять скорость седиментации частиц при помощи одного из вышеупомянутых методов, регистрируя это перемещение на фотопластинке.
Скорость седиментации определяется следующим соотношением:
где х - расстояние от оси вращения в см,
t - время в с,
w - угловая скорость в рад-с -1 ,
s - коэффициент седиментации «молекулы.
Коэффициент седиментации - это скорость, отнесенная к единице ускорения, его измеряют в единицах Сеедберга ; 1 единица Сведберга равна 10 _13 с. Численное значение s зависит от молекулярного веса и формы частиц и является величиной, характерной для данной молекулы или надмолекулярной структуры. Например, коэффициент седиментации лизоцима равен 2,15 S ; катал аза имеет коэффициент седиментации 11.35 S , субъединицы рибосом бактерий - от 30 до 50 S , а субъединицы рибосом эукариотов - от 40 до 60S.
где М - молекулярный вес молекулы, R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, s - коэффициент седиментации молекулы, D - коэффициент диффузии молекулы, v - парциальный удельный объем, который можно рассматривать как объем, занимаемый одним граммом растворенного вещества, р - плотность растворителя.
Метод седиментациоиного равновесия. Определение молекулярных весов этим методом проводится при сравнительно небольших скоростях вращения ротора, порядка 7 000-8 000 об-мин -1 , чтобы молекулы с большим молекулярным весом не осаждались на дно. Ультрацентрифугирование проводят вплоть до достижения частицами равновесия, устанавливающегося под действием центробежных сил, с одной стороны, и диффузионных - с другой, т. е. до тех пор, пока частицы не перестанут перемещаться. Затем по образовавшемуся градиенту концентрации рассчитывают молекулярный вес вещества ‘согласно формуле
где R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, ю - угловая скорость, р - плотность растворителя, v - парциальный удельный объем, с х и с 2 - концентрация растворенного вещества на расстояниях г г и г 2 от оси вращения.
Недостатком данного метода является то, что для достижения седиментациоиного равновесия необходимо длительное время - от нескольких дней до нескольких недель при непрерывной работе центрифуги.
Метод приближения к седиментационному равновесию был разработан для того, чтобы избавиться от недостатков предыдущего метода, связанных с большими затратами времени, необходимого для ‘установления равновесия. С помощью этого метода можно определять молекулярные веса, когда центрифугируемый раствор находится в состоянии приближения к равновесию. Вначале макромолекулы распределяются по всему объему аналитической ячейки равномерно; затем по мере центрифугирования молекулы оседают, и плотность раствора в области мениска постепенно уменьшается. Изменение плотности тщательно регистрируют, а затем путем сложных расчетов, включающих большое число переменных, определяют молекулярный вес данного соединения по формулам:
где R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, v - парциальный удельный объем, р - плотность растворителя, dcldr - градиент концентрации макромолекулы, г м и г д - расстояние до мениска и дна пробирки соответственно, с м и с д - концентрация макромолекул у мениска и у дна пробирки соответственно, М м и M R -величины молекулярных весов, определенные по распределению концентрации вещества у мениска и дна пробирки соответственно.
2.8.2 Оценка чистоты препаратов
Аналитическое ультрацентрифугирование широко применяется для оценки чистоты препаратов ДНК, вирусов и белков. Чистота препаратов несомненно очень важна в тех случаях, когда требуется точно определить молекулярный вес молекулы. В большинстве случаев о гомогенности препарата можно судить по характеру границы седиментации, используя метод определения скорости седиментации: гомогенный препарат обычно дает одну резкоочерченную границу. Присутствующие в препарате примеси проявляются в виде дополнительного пика или плеча; они же обусловливают асимметрию основного пика.
2.8.3 Исследование конформационных изменений в макромолекулах
Еще одна область применения аналитического ультрацентрифугирования - исследование конформационных изменений макромолекул. Молекула ДНК, например, может быть одно- или двухцепочечной, линейной или кольцевой. Под действием различных соединений или при повышенных температурах ДНК претерпевает ряд обратимых и необратимых конформационных изменений, которые можно установить по изменению скорости седиментации образца. Чем компактнее молекула, тем меньше ее коэффициент трения в растворе и наоборот: чем менее она компактна, тем больше коэффициент трения и, следовательно, тем медленнее будет она седиментировать. Таким образом, различия в скорости седиментации образца до и после различных воздействий на него позволяют обнаруживать конформационные изменения, происходящие в макромолекулах.
У аллостерических белков, таких, например, как аспартат-транскарбамоилаза, конформационные изменения возникают в результате связывания их с субстратом и малыми лигандами. Диссоциацию белка на субъединицы можно вызывать, обработав его такими веществами, как мочевина или парахлормеркурибензоат. Все эти изменения легко можно проследить при помощи аналитического ультрацентрифугирования.
