Ce este centrifugarea în biologie. Centrifugarea: tipuri și aplicarea metodei
Centrifugarea
o metodă de separare a sistemelor lichide eterogene, dispersate într-un câmp de forțe centrifuge (câmp centrifugat). Are o capacitate de separare mai mare decât stoarcerea, decantarea și filtrarea. Centrifugele se realizează în centrifuge, al căror principiu de funcționare se bazează pe crearea forței centrifuge, care crește viteza de separare a componentelor amestecului în comparație cu viteza de separare a acestora numai sub influența gravitației. Eficiența centrifugei se apreciază prin „factorul de separare” K, care se calculează folosind formula: K = (2p n) 2 r/g, unde n este numărul de rotații pe minut; r este raza de rotație a rotorului; g este accelerația gravitației. În practică, g este folosit mai des în acest scop, care poate fi găsit din formula de mai sus sau prin formula g = l, 117 x l0 -5 N 2 r, unde N este numărul de rotații; r este raza. Centrifugele constau dintr-o carcasă, un motor, un rotor, un mecanism de transmisie, o cameră de lucru și un panou de control. Pentru o separare mai rapidă a componentelor amestecului, cuiburi pentru eprubete sau pahare sunt așezate în unghi (în rotoarele unghiulare) sau iau această poziție atunci când rotorul orizontal se rotește. Diferențele în ratele de sedimentare a particulelor de amestec cresc odată cu creșterea densității mediului în care are loc separarea. În acest sens, uneori C. se efectuează într-un mediu dens, de exemplu, într-o soluție de zaharoză. În microbiologie, culoarea este folosită pentru a precipita microbii, pentru a elibera suspensiile microbiene de impuritățile grosiere și pentru a crește densitatea microbilor pe unitate. volum și pentru alte scopuri. În funcție de masa microbilor utilizați diverse tipuri centrifuge. În virologie și imunologie, sunt de obicei necesare centrifuge cu un factor de separare ridicat, așa-numitele. super- și ultracentrifuge. Pentru a sedimenta bacteriile, este mai bine să folosiți centrifuge cu un factor de separare de aproximativ 7 mii (9-10 mii rpm). Sedimentarea ciupercilor, protozoarelor, celulelor animale și impurităților grosiere se efectuează în centrifuge cu un factor de separare scăzut (1,5 -3 mii rpm). La concentrații scăzute, procesul de sedimentare a particulelor este întârziat. Poate fi accelerată prin adăugarea unui coagulant sau, de exemplu, bacterii ucise din aceeași specie. Procesul de colorare începe cu echilibrarea pe o scară specială a paharelor cu eprubete care conțin lichid, situate una vizavi de cealaltă în rotor. Garniturile de cauciuc trebuie plasate în partea de jos a ochelarilor. Înainte de centrifugare, închideți bine capacul centrifugei, porniți motorul și creșteți treptat turația rotorului, aducând-o la valoarea setată. După expirarea timpului Ts, motorul este oprit, capacul este deschis după ce rotorul s-a oprit complet. Când aveți de-a face cu microbi vii, este necesar să respectați cu strictețe regulile de asepsie și măsurile de siguranță. Este mai bine să efectuați testarea suspensiilor care conțin microbi în sticlă sau alte eprubete sterilizate în mod fiabil. dopul de bumbac ar trebui să fie buclat în jurul marginii eprubetei sau sticlei și presat cu un inel de cauciuc. Utilizarea capacelor metalice este permisă numai la viteze mici de rotație. Eprubetele nu trebuie umplute la mai mult de 1 cm de margine. Nu puteți folosi eprubete sau sticle obișnuite pentru C. Cm. ultracentrifugă.
(Sursa: Dicționarul de termeni de microbiologie)
- - Orez. 1. Centrifuge. Orez. 1. Centrifuge: 1 tableta de laborator TsLN-2 2 frigidere de laborator TsLR-1...;
Veterinar dicţionar enciclopedic
- - separarea lichidelor în câmpul forţelor centrifuge sisteme dispersate cu particule mai mari de 100 nm. Folosit pentru a izola fazele constituente din sistemele cu două și trei componente. Metode si echipamente...
Enciclopedie chimică
- - separarea sistemelor eterogene cu ajutorul forțelor centrifuge; utilizat pentru separarea suspensiilor, limpezirea lichidelor contaminate, clasificarea nămolului în funcție de dimensiunea particulelor solide etc...
Termeni energie nucleară
- - centrifugare cu gradient de densitate -...
- - centrifugare gradient de densitate de echilibru a zaharozei - .Metoda de separare a macromoleculelor pe baza coeficientului lor de sedimentare
: amestecul de separat este aplicat pe suprafața unei soluții cu un gradient de concentrație de zaharoză <... Biologie moleculară si genetica. Dicţionar
- - centrifugare cu gradient de densitate de echilibru cu clorură de cesiu - Metoda de centrifugare cu gradient de densitate
Biologie moleculară și genetică. Dicţionar - - separarea amestecurilor eterogene în părți componente de diferite densități folosind o centrifugă...
Dicționar medical mare
- - o metodă de betonare a produselor individuale din beton armat în forme de oțel folosind efectul forței centrifuge create de o centrifugă la viteză mare de rotație...
Centrifugarea- separarea sistemelor eterogene (de exemplu, particule lichide - solide) în fracții bazate pe densitate folosind forțe centrifuge. Dispozitivele folosite în acest scop se numesc centrifuge. Partea principală a centrifugei este rotorul cu cuiburi pentru tuburile de centrifugă montate în el. Rotorul se rotește cu viteză mare, în urma cărora se creează forțe centrifuge semnificative, sub influența cărora amestecurile mecanice sunt separate, de exemplu, particulele suspendate în lichid se depun.
Centrifugarea este utilizată pentru a separa sedimentul dintr-o soluție, pentru a separa lichidele contaminate și se realizează și centrifugarea emulsiilor (de exemplu, separarea laptelui). Centrifugarea betonului este utilizată pentru a crește rezistența acestuia. În laboratoarele clinice și sanitare, centrifugarea este utilizată pentru a separa globulele roșii din plasma sanguină, cheagurile de sânge din ser, particulele dense din partea lichidă a urinei etc.
Caracteristicile de proiectare ale centrifugelor constau în metoda de atașare la arborele tamburului și amplasarea acestuia în spațiu. Toate modelele trebuie să asigure, în primul rând, o bună stabilitate a rotorului centrifugei. Deoarece arborele antrenează o masă mare, trebuie să fie deosebit de stabil. Viteza de rotație a arborelui nu trebuie să fie egală cu viteza sa critică de rotație, dar ar trebui să fie mai mare sau mai mică decât aceasta. În primul caz, arborele se numește flexibil, în al doilea, rigid.
Centrifugare preparativă- realizat cu scopul de a obține anumite componente din material biologic pentru analize biochimice ulterioare. Astfel de componente pot fi celule, organele lor (mitocondrii, ribozomi, nuclei etc.) și macromolecule (proteine, ADN etc.).
Centrifugare analitică- efectuat pentru a identifica caracteristicile unui material omogen, de exemplu, macromolecule. Materialul este centrifugat, rezultând precipitarea particulelor sub controlul sistemelor optice. În acest caz, este posibil să se determine omogenitatea, greutatea moleculară și structura acestora, deoarece forma și masa particulelor afectează viteza de depunere. Efectuând calcule folosind formule standard, este posibilă calcularea acestor parametri și compilarea caracteristicilor materialului studiat.
Ultracentrifuga- un dispozitiv pentru separarea particulelor cu dimensiunea mai mică de 100 nm (coloizi, particule subcelulare, macromolecule de proteine, acizi nucleici, lipide, polizaharide, polimeri sintetici etc.), suspendate sau dizolvate într-un lichid. Acest lucru se realizează prin rotirea rotorului, care creează un câmp centrifugal cu o accelerație cu multe ordine de mărime mai mare decât accelerația gravitației.
Analiticultracentrifugarea utilizat pentru studierea omogenității (purității) preparatelor biopolimerice (proteine, acizi nucleici, polizaharide), precum și pentru determinarea constantelor de sedimentare, a greutății moleculare, a constantelor de asociere și a dimensiunilor macromoleculelor. Ultracentrifugarea este utilizată în medicină pentru diagnosticarea clinică, pentru prepararea înlocuitorilor de sânge etc.
Metoda de centrifugare se bazează pe comportamentul diferit al particulelor în câmpul centrifug creat de centrifugă. Proba, situată în vasul de centrifugare, este plasată într-un rotor, care este antrenat de o unitate de centrifugare. Pentru a separa un amestec de particule, este necesar să selectați un set de condiții, cum ar fi viteza de rotație, timpul de centrifugare și raza rotorului. Pentru particulele sferice, viteza de depunere (sedimentare) depinde nu numai de accelerație, ci și de raza și densitatea particulelor, precum și de vâscozitatea mediului în care este depusă proba.
Centrifugarea poate fi împărțită în două tipuri: preparativă și analitică. Centrifugarea preparativă este utilizată atunci când este necesară izolarea unei părți a unei probe pentru cercetări ulterioare. Această metodă este folosită pentru izolarea celulelor din suspensie, macromolecule biologice etc.
Centrifugarea analitică este utilizată pentru a studia comportamentul macromoleculelor biologice într-un câmp centrifugal. Această metodă vă permite să obțineți date despre masa, forma și dimensiunea moleculelor situate în volume relativ mici ale probei. În practica zilnică de laborator, centrifugarea pregătitoare este cel mai des întâlnită.
Centrifugele de laborator pregătitoare, la rândul lor, sunt împărțite în grupuri în funcție de scopul lor: ultracentrifuge preparative, centrifuge de uz general și centrifuge de mare viteză. Centrifugele de uz general au cea mai mare aplicație practică în laboratoarele medicale și au o viteză maximă de până la 6 mii rpm. Principala caracteristică a acestui tip de dispozitiv este capacitatea sa relativ mare - de până la 6 litri, care permite utilizarea pentru centrifugare nu numai a tuburilor de centrifugare cu un volum de până la 100 ml, ci și a recipientelor de până la 1,25 litri. La toate centrifugele de uz general, rotoarele sunt montate rigid pe arborele de antrenare, astfel încât recipientele centrifugate trebuie să fie echilibrate destul de precis. Pentru a evita ruperea, nu încărcați un număr impar de tuburi în rotor, dacă sarcina este incompletă, containerele trebuie plasate unul față de celălalt;
Centrifugele de mare viteză au o viteză maximă de 25 mii rpm și o accelerație de până la 89 mii g. Camera care conține rotorul și probele centrifugate este echipată cu un sistem de răcire pentru a preveni încălzirea cauzată de frecare atunci când rotorul se rotește la viteze mari. De obicei, astfel de centrifuge pot funcționa cu un volum de până la 1,5 litri și sunt echipate cu rotoare unghiulare sau rotoare cu boluri înlocuibile.
Ultracentrifugele preparative accelerează până la 75.000 rpm și au o accelerație centrifugă maximă de 510 mii g. Sunt echipate cu unități frigorifice și de vid pentru a preveni supraîncălzirea rotorului din cauza frecării cu aerul. Rotoarele pentru aceste centrifuge sunt fabricate din titan sau aliaje de aluminiu de înaltă rezistență. Arborele ultracentrifugelor, spre deosebire de centrifugele de mare viteză și de pregătire, este flexibil pentru a reduce vibrațiile atunci când echilibrul rotorului este perturbat. Recipientele din rotor trebuie echilibrate cu grijă până la o zecime de gram.
Centrifugarea preparativă este una dintre metodele de izolare a materialului biologic pentru cercetările biochimice ulterioare. Vă permite să izolați un număr semnificativ de particule celulare pentru un studiu cuprinzător al activității, structurii și morfologiei lor biologice. Metoda este de asemenea aplicabilă pentru izolarea macromoleculelor biologice de bază. Domeniu de utilizare: cercetare medicală, chimică și biochimică.
Clasificarea metodelor de centrifugare preparativă
Centrifugarea pregătitoare se efectuează folosind una dintre următoarele metode:
|
- Izopicnic. Poate fi realizat într-un gradient de densitate sau în mod obișnuit. În primul caz, materialul prelucrat este stratificat pe suprafața unei soluții tampon cu un gradient de densitate continuu și centrifugat până când particulele sunt separate în zone. În al doilea caz, mediul studiat este centrifugat până când se formează un sediment de particule cu greutate moleculară mare, după care particulele studiate sunt izolate de reziduul rezultat.
- Echilibru. Se efectuează într-un gradient de densitate de săruri de metale grele. Centrifugarea vă permite să stabiliți distribuția de echilibru a concentrației substanței de testat dizolvate. Apoi, sub influența forțelor de accelerare centrifuge, particulele de mediu sunt colectate într-o zonă separată a eprubetei.
Metodologia optimă este selectată ținând cont de obiectivele și caracteristicile mediului studiat.
Clasificarea centrifugelor de laborator preparative
În funcție de caracteristicile de proiectare și de caracteristicile operaționale, centrifugele preparative pot fi împărțite în 3 grupuri principale:
 |
|
- Expres. Viteza maximă – 25.000 rpm cu accelerație centrifugă relativă de până la 89.000 g. Pentru a preveni încălzirea din cauza forțelor de frecare care apar atunci când rotorul se rotește, camera de lucru este echipată cu un sistem de răcire. Sunt echipate cu rotoare unghiulare sau rotoare cu recipiente suspendate pentru amplasarea materialului biologic. Capacitate de pregătire de mare viteză
centrifuge – 1,5 dm 3 . - Ultracentrifuge. Viteza maximă – 75.000 rpm cu accelerație centrifugă relativă de până la 510.000 g. Pentru a preveni încălzirea din cauza forțelor de frecare care apar în timpul rotației rotorului, acestea sunt echipate cu un sistem de răcire și o unitate de vid. Rotoarele de ultracentrifugă sunt fabricate din aliaje ultra-rezistente de titan sau aluminiu. Pentru a reduce vibrațiile din cauza umplerii neuniforme, rotoarele au un arbore flexibil.
O categorie separată ar trebui să includă centrifugele pregătitoare cu scop special concepute pentru a efectua anumite tipuri de cercetare și pentru a rezolva probleme specifice. Această grupă include centrifugele cu manta de încălzire, centrifugele frigorifice și alte echipamente similare.
Caracteristici ale designului rotorului în centrifugele pregătitoare
Centrifugele pregătitoare sunt echipate cu rotoare unghiulare sau orizontale:
 |
|
Tipul de rotor determină domeniul de utilizare al echipamentului. Capacitatea de a schimba rotorul vă permite să utilizați același model de centrifugă pentru a rezolva diverse probleme. Centrifugile medicale pentru laboratorul Centurion sunt disponibile în versiuni de pe podea sau de masă, ceea ce face posibilă utilizarea echipamentului în orice încăpere, indiferent de spațiul disponibil.
Lucrări de curs
Centrifugarea
1. Principiul metodei
Separarea substanțelor prin centrifugare se bazează pe comportamentul diferit al particulelor într-un câmp centrifugal. O suspensie de particule plasată într-o eprubetă este încărcată într-un rotor montat pe arborele de antrenare a centrifugei.
Într-un câmp centrifugal, particulele cu densități, forme sau dimensiuni diferite se depun la viteze diferite. Viteza de sedimentare depinde deaccelerație centrifugă, direct proporțională cu viteza unghiulară a rotorului și cu distanța dintre particule și axa de rotație:
iar accelerația centrifugă va fi atunci egală)
Deoarece o rotație a rotorului este2p radiani, viteza unghiulară a rotorului în rotații pe minut poate fi scrisă după cum urmează:
Accelerația centrifugă este de obicei exprimată în unitățig si se numesteaccelerație centrifugă relativă , adică
sau
Când enumerați condițiile pentru separarea particulelor, indicați viteza de rotație și raza rotorului, precum și timpul de centrifugare. Accelerația centrifugă este de obicei exprimată în unitățig , calculată din raza medie de rotație a coloanei de lichidVtub de centrifuga. Pe baza ecuației, Dole și Kotzias au compilat o nomogramă care exprimă dependența OCP de viteza de rotație a rotorului și raza r.
Orez. 2 .1. Nomograma pentru calcularea accelerației centrifuge.
Pentru a determina O, conectați valorile razei și vitezei de rotație a rotorului pe scalele extreme cu o linie dreaptă; punctul de intersecție al acestei linii cu scara medie dă valoarea dorită a accelerației centrifuge. Vă rugăm să rețineți că coloana din dreapta a numerelor scalei DESPRE corespunde coloanei din dreapta de numere de pe scara vitezei rotorului; stânga - stânga.
Viteza de sedimentare a particulelor sferice depinde nu numai de accelerația centrifugă, ci și de densitatea și raza particulelor în sine și de vâscozitatea mediului de suspensie. Timpul necesar pentru sedimentarea unei particule sferice într-un mediu lichid de la meniscul lichid la fundul tubului de centrifugare este invers proporțional cu viteza de sedimentare și este determinat de următoarea ecuație:
Undet - timpul de sedimentare în secunde,rj- vâscozitatea mediului,Gh- raza particulei, ph- densitatea particulelor, p - densitate medie, gm- distanta de la axa de rotatie la meniscul lichidului, gd- distanta de la axa de rotatie pana la fundul eprubetei.
După cum reiese din ecuație, la o anumită viteză a rotorului, timpul necesar pentru stabilirea particulelor sferice omogene este invers proporțional cu pătratul razelor lor și cu diferența dintre densitățile particulelor și a mediului și este direct proporțional cu vâscozitatea mediu. Prin urmare, un amestec de particule eterogene, aproximativ sferice, care diferă ca densitate și dimensiune, poate fi separat fie datorită timpilor diferiți de depunere a acestora pe fundul eprubetei la o accelerație dată, fie datorită distribuției particulelor de sedimentare de-a lungul eprubetă, stabilită după o anumită perioadă de timp. La separarea substanțelor, este necesar să se țină cont de factori atât de importanți precum densitatea și vâscozitatea mediului. Folosind metodele descrise, este posibilă separarea organelelor celulare de omogenate tisulare. Componentele principale ale celulei sunt depuse în următoarea succesiune: mai întâi, celule întregi și fragmentele lor, apoi nuclee, cloroplaste, mitocondrii, lizozomi, microzomi și, în final, ribozomi. Depunerea particulelor nesferice nu urmează o ecuație, astfel încât particulele de aceeași masă, dar de forme diferite, se depun la viteze diferite. Această caracteristică este utilizată atunci când se studiază conformația macromoleculelor folosind ultracentrifugarea.
constă în izolarea materialului biologic pentru studii biochimice ulterioare. În acest caz, este posibil să se ia cantități mari de material biologic inițial, de exemplu, însămânțarea celulelor microbiene din culturi discontinue sau continue, precum și însămânțarea celulelor vegetale și animale din culturi de țesuturi și plasma sanguină. Folosind centrifugarea preparativă, un număr mare de particule celulare sunt izolate pentru a le studia morfologia, structura și activitatea biologică. Metoda este, de asemenea, utilizată pentru a izola macromolecule biologice, cum ar fi ADN-ul și proteinele din preparate pre-purificate.
Centrifugare analitică utilizat în principal pentru studiul preparatelor pure sau esențial pure de macromolecule sau particule, cum ar fi ribozomii. În acest caz, se utilizează o cantitate mică de material, iar sedimentarea particulelor studiate este înregistrată continuu folosind sisteme optice speciale. Metoda vă permite să obțineți date despre puritatea, greutatea moleculară și structura materialului. În atelierele pentru studenți, centrifugarea pregătitoare este folosită mult mai des decât centrifugarea analitică, așa că ne vom opri mai detaliat asupra ei, deși ambele metode se bazează pe principii generale.
2. Centrifugare preparativă
2 .1 Centrifugare diferențială
Această metodă se bazează pe diferențele în ratele de sedimentare ale particulelor care diferă ca mărime și densitate. Materialul care trebuie separat, de exemplu omogenat de țesut, este centrifugat cu o creștere treptată a accelerației centrifuge, care este selectată astfel încât în fiecare etapă o anumită fracțiune să fie depusă la fundul tubului. La sfârșitul fiecărei etape, precipitatul este separat de supernatant și spălat de mai multe ori pentru a obține în final o fracție pură de precipitat. Din păcate, este aproape imposibil să se obțină un sediment absolut pur; Pentru a înțelege de ce se întâmplă acest lucru, să ne uităm la procesul care are loc într-un tub de centrifugă la începutul fiecărei etape de centrifugare.
La început, toate particulele de omogenat sunt distribuite uniform în volumul tubului de centrifugare, astfel încât este imposibil să se obțină preparate pure de sedimente ale celor mai grele particule într-un ciclu de centrifugare: primul sediment format conține în principal particulele cele mai grele, dar, în plus, și o anumită cantitate din toate componentele originale. O pregătire suficient de pură a particulelor grele poate fi obținută numai prin resuspendarea și centrifugarea sedimentului original. Centrifugarea ulterioară a supernatantului cu o creștere ulterioară a accelerației centrifuge duce la sedimentarea particulelor de dimensiune și densitate medie și apoi la sedimentarea particulelor cele mai mici cu densitatea cea mai mică. În fig. Figura 2.3 prezintă o diagramă a fracționării omogenatului de ficat de șobolan.
Orez. 2.2. Centrifugare diferențială a unei suspensii de particule într-un câmp centrifugal.
În primul rând, particulele sunt distribuite uniform pe întregul volum al tubului de centrifugă (O): În timpul centrifugării, particulele sunt sedimentate în funcție de dimensiunea și forma lor (b - d).
Orez. 2.3. Schema de fracționare a omogenatului de ficat de șobolan în fracții subcelulare.
Centrifugarea diferențială este probabil cea mai comună metodă pentru izolarea organelelor celulare din omogenate tisulare. Această metodă este folosită cu cel mai mare succes pentru a separa organele celulare care diferă semnificativ unele de altele ca mărime și densitate. Dar chiar și în acest caz, fracțiile rezultate nu sunt niciodată absolut omogene și alte metode descrise mai jos sunt utilizate pentru separarea lor ulterioară. Aceste metode, bazate pe diferențele în densitatea organelelor, asigură separări mai eficiente prin efectuarea centrifugării în soluții cu un gradient de densitate continuu sau treptat. Dezavantajul acestor metode este că este nevoie de timp pentru a obține un gradient de densitate a soluției.
2.2 Centrifugare zona-viteză
Metoda vitezei zonale sau, cum se mai numește,s-centrifugarea zonala consta in stratificarea probei de testat pe suprafata unei solutii cu un gradient de densitate continuu. Proba este apoi centrifugată până când particulele sunt distribuite de-a lungul gradientului în zone sau benzi discrete. Prin crearea unui gradient de densitate se evită amestecarea zonelor rezultate din convecție. Metoda de centrifugare a zonei de viteză este utilizată pentru a separa hibrizii ARN-ADN, subunitățile ribozomale și alte componente celulare.
Orez. 2 .4. Viteza și separarea izopicnală a particulelor într-un gradient de densitate. Înainte de începerea centrifugării, suspensia de particule este stratificată deasupra unui gradient de densitate a lichidului (O). La centrifugare de mare viteză, particulele nu ajung la punctul izopicnic, iar la separare izopicnală, centrifugarea este continuată până când particulele studiate ating o zonă cu densitatea corespunzătoare. (b).
2.3 Centrifugare izopicnică
Centrifugarea izopicnică se realizează atât în gradient de densitate, cât și în mod obișnuit. Dacă centrifugarea nu se efectuează într-un gradient de densitate, preparatul este mai întâi centrifugat astfel încât particulele a căror greutate moleculară este mai mare decât cea a particulelor studiate să se depună. Aceste particule grele sunt aruncate și proba este suspendată într-un mediu a cărui densitate este aceeași cu cea a fracției de izolat și apoi centrifugate până când particulele de interes se depun la fundul tubului și particulele cu densitate mai mică plutesc la nivelul suprafata lichidului..
Orez. 2.5. Separare izopicnală fără gradient de densitate.
Înainte de centrifugare, particulele sunt distribuite uniform în volumul tubului de centrifugare (O). După centrifugare, particulele mai ușoare plutesc în partea de sus, în timp ce particulele mai grele se depun în partea de jos a tubului (b)
O altă metodă este de a stratifica proba pe suprafața soluției cu un gradient de densitate continuu care acoperă gama de densități ale tuturor componentelor amestecului. Centrifugarea se efectuează până când densitatea plutitoare a particulelor este egală cu densitatea zonelor corespunzătoare, adică până când particulele sunt separate în zone. Metoda se numește centrifugare zonal-izopicnală sau rezonantă, deoarece punctul principal aici este densitatea plutitoare și nu dimensiunea sau forma particulelor. Densitatea la care particulele formează benzi izopicnice este influențată de natura mediului de suspensie; particulele pot fi permeabile la unii compuși în soluție și impermeabile la alții sau pot atașa moleculele soluției. La utilizarea unui rotor zonal, mitocondriile, lizozomii, peroxizomii și microzomii sunt concentrați în benzi cu zaharoză 42%, 47%, 47% și 27%, corespunzătoare densităților de 1,18, 1,21, 1,21 și 1,10 g-cm.-3 respectiv. Densitatea organelelor subcelulare depinde și de absorbția selectivă a anumitor compuși. Administrarea detergentului nehemolitic Triton la șobolaniWR-1339 duce la creșterea dimensiunii și scăderea densității lizozomilor hepatici; densitatea mitocondriilor și a peroxizomilor rămâne neschimbată. În ciuda faptului că proprietățile de sedimentare ale lizozomilor, de regulă, nu se modifică, densitatea lor de echilibru în gradientul de zaharoză scade de la 1,21 la 1,1, ceea ce duce la o separare corespunzătoare a fracției lizozomal-peroxizomale. Această caracteristică este utilizată în separarea cantitativă a lizozomilor, mitocondriilor și peroxizomilor, bazată pe îndepărtarea dintr-un mediu omogen a tuturor particulelor cu o densitate mai mare decât cea a microzomilor și centrifugarea izopicnală ulterioară a particulelor grele precipitate.
2.4 Centrifugare cu gradient de densitate de echilibru
Pentru a crea un gradient de densitate, se folosesc săruri ale metalelor grele, cum ar fi rubidiu sau cesiu, precum și soluții de zaharoză. Proba, cum ar fi ADN-ul, este amestecată cu o soluție concentrată de clorură de cesiu. Atât solutul, cât și solventul sunt inițial distribuite uniform în volum. În timpul centrifugării, se stabilește o distribuție de echilibru a concentrației și, prin urmare, a densitățiiCsCl, deoarece ionii de cesiu au o masă mare. Sub influența accelerației centrifuge, moleculele de ADN sunt redistribuite, colectându-se sub forma unei zone separate într-o parte a eprubetei cu o densitate corespunzătoare. Metoda este folosită în principal în centrifugarea analitică și a fost folosită de Meselson și Stahl pentru a studia mecanismul de replicare a ADN-uluiE. coli . Centrifugarea cu gradient de densitate de echilibru este, de asemenea, una dintre metodele de separare și studiere a lipoproteinelor din plasma sanguină umană.
2. 5 Generarea și extragerea gradienților
2.5.1 Natura gradienților
Pentru a crea gradienți de densitate în soluții, cel mai des se folosesc soluții de zaharoză, uneori cu un pH fix. În unele cazuri, se obține o bună separare atunci când este folosită în locul apei obișnuiteD2 0. În tabel. Tabelul 2.1 prezintă proprietățile unor soluții de zaharoză.
Concentrație, %
Proprietățile soluțiilor de zaharoză
Alegerea gradientului este dictată de obiective specifice de fracţionare. De exemplu, ficol, produs de companieFarmacia Amenda Produse chimice, poate înlocui zaharoza în cazurile în care este necesar să se creeze gradienți cu densitate mare și presiune osmotică scăzută. Un alt avantaj al Ficol este că nu trece prin membranele celulare. Pentru a crea gradienți de densitate mai mare, se folosesc săruri ale metalelor grele, cum ar fi rubidiu și cesiu, dar datorită efectului coroziv.CsClastfel de gradienți sunt utilizați numai în rotoarele din metale rezistente, cum ar fi titanul".
2.5.2 Metoda de creare a unui gradient de densitate a treptei
Pentru a crea un gradient de densitate, mai multe soluții cu densitate în scădere succesiv sunt pipetate cu atenție într-un tub de centrifugă. Apoi proba este stratificată pe stratul superior, care are cea mai mică densitate, sub forma unei zone înguste, după care tubul este centrifugat. Gradienți liniari netezi pot fi obținuți prin netezirea gradienților de trepte atunci când soluția stă mult timp. Procesul poate fi accelerat amestecând ușor conținutul tubului cu un fir sau scuturând ușor tubul.
2.5.3 Metoda de creare a unui gradient de densitate neted
În cele mai multe cazuri, se folosește un dispozitiv special pentru a crea un gradient de densitate neted. Este alcătuit din două vase cilindrice cu diametru identic strict definit, care comunică între ele în partea de jos folosind un tub de sticlă cu o supapă de control, care vă permite să reglați proporțiile în care este amestecat conținutul ambelor vase. Unul dintre ele este echipat cu un agitator și are o ieșire prin care soluția curge în tuburile de centrifugă. Soluția mai densă se pune în mixer; al doilea cilindru este umplut cu o soluție de densitate mai mică. Înălțimea coloanei de soluție din ambii cilindri este stabilită astfel încât presiunea hidrostatică din acestea să fie aceeași. Soluția mai densă este eliberată treptat din mixer în tuburile de centrifugă și este înlocuită simultan cu un volum egal de soluție cu densitate mai mică care intră în mixer din al doilea cilindru prin supapa de control. Omogenitatea soluției din mixer este asigurată prin agitarea constantă a soluției cu ajutorul unui agitator. Pe măsură ce soluția este turnată în tuburi de centrifugă, densitatea acesteia scade și se creează un gradient de densitate liniar în tuburi. Gradienții neliniari pot fi creați folosind un sistem format din doi cilindri cu diametru inegal.
Pentru a forma gradienți de densitate cu abrupte variabilă, se folosește un sistem de două seringi controlate mecanic, care sunt umplute cu soluții de densitate inegală. Se pot crea diferite gradiente prin modificarea vitezei relative a pistoanelor.
2.5.4 Îndepărtarea gradienților din tuburile de centrifugă
După ce centrifugarea și separarea particulelor sunt finalizate, zonele rezultate trebuie îndepărtate. Acest lucru se face în mai multe moduri, cel mai adesea prin deplasare. Tubul de centrifugare este străpuns la bază și un mediu foarte dens, de exemplu o soluție de zaharoză 60-70%, este introdus lent în partea inferioară. Soluția de deasupra este deplasată, iar fracțiile sunt colectate folosind o seringă, o pipetă sau un dispozitiv special conectat printr-un tub la colectorul de fracții. Dacă tuburile sunt din celuloid sau nitroceluloză, fracțiile sunt îndepărtate prin tăierea tubului cu o lamă specială. Pentru a face acest lucru, un tub de centrifugă fixat într-un suport este tăiat direct sub zona dorită și fracțiunea este aspirată cu o seringă sau o pipetă. Cu un design adecvat al dispozitivului de tăiere, pierderea soluției va fi minimă. Fracțiile sunt de asemenea colectate prin străpungerea bazei tubului cu un ac subțire gol. Picăturile care curg din tub prin ac sunt colectate într-un colector de fracțiuni pentru analize ulterioare.
2.5.5 Centrifuge preparative și aplicațiile acestora
Centrifugele preparative pot fi împărțite în trei grupe principale: centrifuge de uz general, centrifuge de mare viteză și ultracentrifuge preparative.Centrifuge de uz general dați o turație maximă de 6000 rpm-1 și OCU până la 6000g . Ele diferă între ele doar prin capacitate și au un număr de rotoare înlocuibile: unghiulare și cu cupe suspendate. Una dintre caracteristicile acestui tip de centrifugă este capacitatea sa mare - de la 4 la 6 dm3 , care vă permite să le încărcați nu numai cu tuburi de centrifugă de 10,50 și 100 cm3 , dar și vase cu o capacitate de până la 1,25 dm3 . La toate centrifugele de acest tip, rotoarele sunt montate rigid pe arborele de antrenare, iar tuburile centrifugei, împreună cu conținutul lor, trebuie să fie echilibrate cu grijă și să difere în greutate cu cel mult 0,25 g. Un număr impar de tuburi nu trebuie să fie încărcate în rotor, iar dacă rotorul nu este încărcat complet, tuburile trebuie așezate simetric, unul față de celălalt, asigurând astfel o distribuție uniformă a tuburilor în raport cu axa de rotație a rotorului.
Centrifuge de mare viteză dați o viteză maximă de 25.000 rpm-1 și OCU până la 89000g. Camera rotorului este echipată cu un sistem de răcire care previne căldura care apare din cauza frecării atunci când rotorul se rotește. De obicei, centrifugele de mare viteză au o capacitate de 1,5 dm33 și sunt echipate cu rotoare înlocuibile, atât unghiulare, cât și cu cupe suspendate.
Ultracentrifuge preparative oferă o viteză maximă de până la 75.000 rpm-1 iar accelerația centrifugă maximă 510.000g . Sunt echipate atât cu un frigider, cât și cu o unitate de vid pentru a preveni supraîncălzirea rotorului din cauza frecării cu aerul. Rotoarele unor astfel de centrifuge sunt fabricate din aliaje de aluminiu sau titan de înaltă rezistență. Rotoarele din aliaje de aluminiu sunt utilizate în principal, dar în cazurile în care sunt necesare viteze deosebit de mari, se folosesc rotoare din titan. Pentru a reduce vibrațiile rezultate din dezechilibrul rotorului din cauza umplerii neuniforme a tuburilor de centrifugă, ultracentrifugele au un arbore flexibil. Tuburile de centrifugare și conținutul lor trebuie echilibrate cu atenție la cel mai apropiat 0,1 g. Cerințe similare trebuie respectate la încărcarea rotoarelor centrifugelor de uz general.
2.6 Designul rotorului
2.6.1 Rotoare unghiulare și rotoare cu boluri suspendate
Rotoarele de centrifugă pregătitoare sunt de obicei de două tipuri - unghiulare și cu boluri suspendate. Ele sunt numite unghiulare deoarece tuburile de centrifugă plasate în ele sunt întotdeauna la un anumit unghi față de axa de rotație. În rotoarele cu pahare suspendate, eprubetele sunt instalate vertical, iar atunci când sunt rotite sub acțiunea forței centrifuge rezultate, se deplasează în poziție orizontală; unghiul de înclinare față de axa de rotație este de 90°.
La rotoarele cu unghi drept, distanța parcursă de particule până la peretele corespunzător al eprubetei este foarte mică și, prin urmare, sedimentarea are loc relativ rapid. După ciocnirea cu pereții eprubetei, particulele alunecă în jos și formează un sediment în partea de jos. În timpul centrifugării, apar curenți de convecție, care complică foarte mult separarea particulelor cu proprietăți de sedimentare similare. Cu toate acestea, rotoarele cu un design similar sunt utilizate cu succes pentru a separa particulele ale căror viteze de sedimentare variază destul de semnificativ.
La rotoarele cu cupe suspendate se observă și fenomene de convecție, dar nu sunt atât de pronunțate. Convecția este rezultatul faptului că, sub influența accelerației centrifuge, particulele se depun într-o direcție nu strict perpendiculară pe axa de rotație și, prin urmare, ca și în rotoarele unghiulare, lovesc pereții eprubetei și alunecă spre fund.
Efectele de convecție și vortex pot fi evitate într-o oarecare măsură prin utilizarea tuburilor sectoriale în rotoarele cu bol suspendate și prin ajustarea vitezei rotorului; Metoda de centrifugare cu gradient de densitate nu are, de asemenea, dezavantajele enumerate mai sus.
2.6.2 Rotoare continue
Rotoarele continue sunt proiectate pentru fracționarea cu viteză mare a cantităților relativ mici de material solid din suspensii de volum mare, de exemplu pentru izolarea celulelor din mediile de cultură. În timpul centrifugării, o suspensie de particule este adăugată continuu la rotor; Capacitatea rotorului depinde de natura produsului depus și variază de la 100 cm3 până la 1 dm3 in 1 min. Particularitatea rotorului este că este o cameră izolată cu un design special; conținutul său nu comunică cu mediul extern și, prin urmare, nu se poluează sau se dispersează.
2.6.3 Rotoare de zonă sau rotoare Anderson
Orez. 2 .6. Etapele de centrifugare (a- e) într-un rotor zonal
Rotoarele zonale sunt fabricate din aliaje de aluminiu sau titan, care sunt capabile să reziste la accelerații centrifuge foarte semnificative. De obicei, au o cavitate cilindrică care este închisă cu un capac detașabil. În interiorul cavității, pe axa de rotație, se află un tub axial pe care este plasată o duză cu pale, care împarte cavitatea rotorului în patru sectoare. Paletele sau deflectoarele au canale radiale prin care este forțat un gradient de la tubul axial la periferia rotorului. Datorită acestui design al lamelor, convecția este redusă la minimum.
Rotorul este umplut atunci când se rotește cu o viteză de aproximativ 3000 rpm-1 . Un gradient pre-creat este pompat în rotor, pornind de la un strat de cea mai mică densitate, care este distribuit uniform de-a lungul periferiei rotorului și este menținut la peretele său exterior perpendicular pe axa de rotație datorită forței centrifuge.. Pe măsură ce straturile de gradient de densitate mai mare sunt adăugate ulterior, există o deplasare continuă către centrul straturilor mai puțin dense. După ce întregul gradient a fost pompat în rotor, acesta este umplut până la volumul său complet cu o soluție numită „pernă”, a cărei densitate se potrivește sau depășește puțin cu cea mai mare densitate a gradientului preformat.
Apoi, prin tubul axial, proba de testat este stratificată, care este forțat să iasă din tub în volumul rotorului folosind o soluție de densitate mai mică, în acest caz, același volum al „pernei” este îndepărtat de la periferie. După toate aceste proceduri, viteza de rotație a rotorului este adusă la viteza de funcționare și se efectuează fie fracționarea zonal-viteză, fie zonal-izopicnală pentru perioada de timp necesară.. Extracția fracțiilor se realizează la o turație a rotorului de 3000 rpm-1 . Conținutul rotorului este deplasat prin adăugarea unei „perne” de la periferie, straturile mai puțin dense sunt deplasate mai întâi. Datorită designului special al canalului axial al rotorului Anderson, amestecarea zonelor atunci când acestea sunt deplasate nu are loc. Gradientul de ieșire este trecut printr-un dispozitiv de înregistrare, de exemplu celula unui spectrofotometru, cu ajutorul căruia conținutul de proteine poate fi determinat prin absorbanță la 280 nm, sau printr-un detector special de radioactivitate, după care se colectează fracțiile.
Capacitatea rotoarelor zonale utilizate la viteze medii variază de la 650 la 1600 cm3 , care vă permite să obțineți o cantitate destul de mare de material. Rotoarele de zonă sunt folosite pentru a îndepărta impuritățile proteice din diferite preparate și pentru a izola și purifica mitocondriile, lizozomii, polizomii și proteinele.
2.6.4 Analiza fracțiilor subcelulare
Proprietățile particulelor subcelulare obținute în timpul fracționării medicamentului pot fi atribuite proprietăților particulelor în sine numai dacă medicamentul nu conține impurități. Prin urmare, este întotdeauna necesar să se evalueze puritatea preparatelor rezultate. Eficacitatea omogenizării și prezența impurităților în preparat pot fi determinate folosind examenul microscopic. Cu toate acestea, absența impurităților vizibile nu este încă o dovadă de încredere a purității medicamentului. Pentru cuantificarea purității, preparatul rezultat este supus unei analize chimice, ceea ce face posibilă determinarea conținutului său de proteine sau ADN, a activității sale enzimatice, dacă este posibil, și a proprietăților sale imunologice.
Analiza distribuției enzimelor în țesuturile fracționate se bazează pe două principii generale. Prima dintre acestea este că toate particulele unei populații subcelulare conțin același set de enzime. Al doilea presupune că fiecare enzimă este localizată într-o locație specifică în interiorul celulei. Dacă această poziție ar fi adevărată, atunci enzimele ar putea acționa ca markeri pentru organelele corespunzătoare: de exemplu, citocrom oxidaza și monoaminoxidaza ar servi ca enzime marker pentru mitocondrii, hidrolazele acide ca markeri pentru lizozomi, catalaza ca marker pentru peroxizomi și glucoză. 6-fosfataza - un marker al membranelor microzomale. S-a dovedit însă că unele enzime, cum ar fi malat dehidrogenaza,R -glucuronidaza, NADP'H-citocrom c-reductaza, sunt localizate in mai mult de o fractiune. Prin urmare, selecția markerilor enzimatici pentru fracțiile subcelulare în fiecare caz specific ar trebui abordată cu mare prudență. Mai mult, absența unei enzime marker nu înseamnă absența organelelor corespunzătoare. Este probabil ca în timpul fracționării enzima să se piardă din organele sau să fie inhibată sau inactivată; prin urmare, cel puțin două enzime marker sunt de obicei determinate pentru fiecare fracție.
Fracţiune
2.7 Fracționarea prin centrifugare diferențială
2.7.1 Prezentarea rezultatelor
Rezultatele obţinute din fracţionarea ţesuturilor sunt prezentate cel mai convenabil sub formă de grafice. Astfel, atunci când se studiază distribuția enzimelor în țesuturi, datele sunt cel mai bine prezentate sub formă de histograme, care fac posibilă evaluarea vizuală a rezultatelor experimentelor.
Conținutul de proteină cu activitate enzimatică din probă este determinat atât în omogenatul original, cât și în fiecare fracție subcelulară izolată separat. Activitatea enzimatică totală și conținutul de proteine din fracții nu ar trebui să difere foarte mult de valorile corespunzătoare din omogenatul original.
Apoi se calculează activitatea enzimatică și conținutul de proteine din fiecare fracție ca procent din randamentul total, pe baza căruia se întocmește o histogramă. Cantitatea relativă de proteină din fiecare fracție în ordinea izolării lor este reprezentată secvenţial de-a lungul axei absciselor, iar activitatea specifică relativă a fiecărei fracţiuni este reprezentată de-a lungul axei ordonatelor. Astfel, activitatea enzimatică a fiecărei fracțiuni este determinată de aria coloanelor.
2.7.2 Ultracentrifugarea analitică
Spre deosebire de centrifugarea preparativă, al cărei scop este separarea substanțelor și purificarea lor, ultracentrifugarea analitică este utilizată în principal pentru a studia proprietățile de sedimentare ale macromoleculelor biologice și ale altor structuri. Prin urmare, în centrifugarea analitică se folosesc rotoare și sisteme de înregistrare cu un design special: permit monitorizarea continuă a sedimentării materialului.V câmp centrifugal.
Ultracentrifugele analitice pot atinge viteze de până la 70.000 rpm -1 , creând o accelerație centrifugă de până la 500.000g . Rotorul lor, de regulă, are forma unui elipsoid și este conectat printr-un șir la un motor, ceea ce vă permite să variați viteza de rotație a rotorului. Rotorul se rotește într-o cameră de vid dotată cu un dispozitiv de refrigerare și are două celule, analitice și de echilibrare, care sunt instalate strict vertical în centrifugă, paralele cu axa de rotație. Celula de echilibrare servește la echilibrarea celulei analitice și este un bloc metalic cu sistem de precizie. Are și două orificii index, situate la o distanță strict definită de axa de rotație, cu ajutorul cărora se determină distanțele corespunzătoare în celula analitică. O celulă analitică a cărei capacitate este de obicei de 1 cm 3 , are o formă sectorială. Când este instalat corect în rotor, în ciuda faptului că stă vertical, funcționează pe același principiu ca un rotor cu cupe suspendate, creând condiții de sedimentare aproape ideale. La capetele celulei analitice sunt ferestre cu ochelari de cuarț. Ultracentrifugele analitice sunt echipate cu sisteme optice care permit observarea sedimentării particulelor pe toată perioada de centrifugare. La intervale specificate, materialul sedimentat poate fi fotografiat. La fracționarea proteinelor și ADN-ului, sedimentarea este monitorizată prin absorbție în ultraviolete, iar în cazurile în care soluțiile studiate au indici de refracție diferiți - folosind sistemul Schlieren sau sistemul de interferență Rayleigh. Ultimele două metode se bazează pe faptul că, atunci când lumina trece printr-o soluție transparentă constând din zone cu densități diferite, refracția luminii are loc la limita zonelor. În timpul sedimentării, se formează o graniță între zonele cu particule grele și ușoare, care acționează ca o lentilă de refracție; în acest caz, pe placa fotografică folosită ca detector apare un vârf. În timpul sedimentării, granița se mișcă și, în consecință, vârful, după viteza căruia se poate judeca viteza de sedimentare a materialului. Sistemele interferometrice sunt mai sensibile decât sistemele schlieren. Celulele analitice sunt cu un singur sector, care sunt cele mai des utilizate, și cu două sectoare, care sunt utilizate pentru studiul comparativ al solventului și al solutului.
În biologie, ultracentrifugarea analitică este utilizată pentru a determina greutățile moleculare ale macromoleculelor, pentru a verifica puritatea probelor rezultate și, de asemenea, pentru a studia modificările conformaționale ale macromoleculelor.
2.8 Aplicații ale ultracentrifugării analitice
2.8.1 Determinarea greutăților moleculare
Există trei metode principale pentru determinarea greutăților moleculare folosind ultracentrifugarea analitică: determinarea vitezei de sedimentare, metoda echilibrului de sedimentare și metoda de aproximare a echilibrului sedimentării.
Determinarea masei moleculare prin viteza de sedimentare - aceasta este cea mai comună metodă. Centrifugarea se efectuează la viteze mari, astfel încât particulele, inițial distribuite uniform pe întregul volum, încep să se miște ordonat de-a lungul unei raze de la centrul de rotație. Se formează o interfață clară între regiunea solventului, deja lipsită de particule, și partea care le conține. Această limită se mișcă în timpul centrifugării, ceea ce face posibilă determinarea vitezei de sedimentare a particulelor folosind una dintre metodele de mai sus, înregistrând această mișcare pe o placă fotografică.
Viteza de sedimentare este determinată de următoarea relație:
UndeX - distanta de la axa de rotatie in cm,
t - timpul în s,
w- viteza unghiulara in rad-s -1 ,
s - coeficientul de sedimentare al „moleculei.
Coeficientul de sedimentare este viteza pe unitatea de accelerație, se măsoară înunități Seedberg ; 1 unitate Svedberg este egală cu 10 _13 Cu. Valoare numericăsdepinde de greutatea moleculară și forma particulelor și este o valoare caracteristică unei anumite molecule sau structuri supramoleculare. De exemplu, coeficientul de sedimentare al lizozimei este 2,15S; catal aza are un coeficient de sedimentare de 11,35S, subunități ale ribozomilor bacterieni - de la 30 la 50Sși subunități ribozomale eucariote - de la 40 la 60S.
UndeM - greutatea moleculară a moleculei,R - constanta de gaz,T - temperatura absoluta,s- coeficientul de sedimentare a moleculei,D - coeficientul de difuzie al moleculei,v - volum specific parțial, care poate fi considerat ca volumul ocupat de un gram de substanță dizolvată, p - densitatea solventului.
Metoda echilibrului de sedimentare. Determinarea greutăților moleculare prin această metodă se realizează la viteze relativ mici ale rotorului, aproximativ 7.000-8.000 rpm -1 astfel încât moleculele cu greutate moleculară mare să nu se depună la fund. Ultracentrifugarea se efectuează până când particulele ating echilibrul, care se stabilește sub influența forțelor centrifuge, pe de o parte, și a forțelor de difuzie, pe de altă parte, adică până când particulele încetează să se miște. Apoi, din gradientul de concentrație rezultat, greutatea moleculară a substanței se calculează conform formulei
UndeR - constanta de gaz,T - temperatura absolută, ω - viteza unghiulară, p - densitatea solventului,v - volum specific parțial,Cu X ŞiCu 2 - concentrația de dizolvat pe distanțeG G și g 2 din axa de rotație.
Dezavantajul acestei metode este că pentru a atinge echilibrul de sedimentare este nevoie de mult timp - de la câteva zile la câteva săptămâni cu funcționarea continuă a centrifugei.
Metoda de abordare a echilibrului de sedimentare a fost dezvoltat pentru a scăpa de dezavantajele metodei anterioare asociate cu timpul mare necesar pentru „stabilirea echilibrului”. Folosind această metodă, greutățile moleculare pot fi determinate atunci când soluția centrifugată este aproape de echilibru. Inițial, macromoleculele sunt distribuite uniform pe întregul volum al celulei analitice; apoi, pe măsură ce centrifugarea continuă, moleculele se stabilesc, iar densitatea soluției în regiunea meniscului scade treptat. Modificarea densității este înregistrată cu atenție, iar apoi, prin calcule complexe care implică un număr mare de variabile, greutatea moleculară a unui anumit compus este determinată folosind formulele:
UndeR - constanta de gaz,T - temperatura absoluta,v - volum specific parțial, p - densitatea solventului,dcldr - gradient de concentrație a macromoleculei, g mși g d- distanta pana la menisc si respectiv fundul eprubetei, s msi cu d- concentrația de macromolecule la menisc și, respectiv, la fundul eprubetei,M m ŞiM R - valorile masei moleculare determinate din distribuția concentrației substanței la menisc și, respectiv, la fundul eprubetei.
2.8.2 Evaluarea purității medicamentului
Ultracentrifugarea analitică este utilizată pe scară largă pentru a evalua puritatea preparatelor de ADN, virus și proteine. Puritatea preparatelor este, fără îndoială, foarte importantă în cazurile în care este necesară determinarea cu precizie a greutății moleculare a unei molecule. În cele mai multe cazuri, omogenitatea unui preparat poate fi judecată după natura limitei de sedimentare, folosind metoda de determinare a vitezei de sedimentare: un preparat omogen dă de obicei o limită bine definită. Impuritățile prezente în preparat apar ca un vârf sau umăr suplimentar; ele determină şi asimetria vârfului principal.
2.8.3 Studiul modificărilor conformaționale în macromolecule
Un alt domeniu de aplicare a ultracentrifugării analitice este studiul modificărilor conformaționale în macromolecule. O moleculă de ADN, de exemplu, poate fi monocatenară sau dublă, liniară sau circulară. Sub influența diverșilor compuși sau la temperaturi ridicate, ADN-ul suferă o serie de modificări conformaționale reversibile și ireversibile, care pot fi determinate de modificările ratei de sedimentare a probei. Cu cât molecula este mai compactă, cu atât coeficientul său de frecare în soluție este mai mic și invers: cu cât este mai puțin compactă, cu atât coeficientul de frecare este mai mare și, prin urmare, cu atât se va sedimenta mai lent. Astfel, diferențele în viteza de sedimentare a unei probe înainte și după diferitele influențe asupra acesteia fac posibilă detectarea modificărilor conformaționale care apar în macromolecule.
În proteinele alosterice, cum ar fi aspartat transcarbamoilaza, apar modificări conformaționale ca urmare a legării lor la substrat și liganzii mici. Disocierea proteinei în subunități poate fi cauzată de tratarea acesteia cu substanțe precum ureea sau paracloromercuribenzoatul. Toate aceste modificări pot fi monitorizate cu ușurință folosind ultracentrifugarea analitică.
