Генетика бактерий и вирусов. Генетический материал бактерий У конъюгативных плазмид в структуре есть генетический элемент трансмиссивности, обеспечивающий передачу генетической информации

Современная биология и генетика обязаны своими выдающимися достижениями микробиологии, которая предоставила им микроорганизмы в качестве экспериментальных объектов. Важность и актуальность исследований в области генетики микроорганизмов заключается прежде всего в том, что они впервые создали методы управления наследственностью.

В 1865 году чешский ученый Грегор Мендель открыл существование генов как дискретных единиц наследственности. В 1928 году Ф. Гриффитс впервые осуществил трансформацию невирулентных пневмококков в вирулентные. Он заразил белых мышей смесью бактерий, состоящей из убитых нагреванием, следовательно, потерявших вирулентность капсульных пневмококков и живых бескапсульных невирулентных пневмококков. В контрольных опытах эти группы бактерий, введенные порознь, мышей не убивали. Однако в опытной группе мыши погибли и из крови их были выделены живые пневмококки, приобретшие капсулу убитых пневмококков. Следовательно, убитые капсульные пневмококки содержали вещество, способное передать признак капсулообразования (вирулентности) живым пневмококкам. Механизм трансформации оставался неизвестным.

В 1953 году Ф. Крик и Д. Уотсон определили структуру гена, основанную на двойной спирали ДНК. Это открытие показало, каким образом ген выполняет свои три важнейшие функции:

• 1) непрерывность наследственности - полуконсервативным механизмом репликации ДНК;
• 2) управление структурами и функциями организма - с помощью генетического кода, использующего запас всего из четырех оснований (букв) - аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц);
• 3) эволюцию организмов благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям.

Работами Ф. Крика, С. Бреннера, М. Ниренберга, С. Очоа, X. Кораны с использованием микробных объектов к 1966 г. генетический код был расшифрован, показана его триплетность, неперекрываемость и универсальность для всех живых организмов.

Ученые оценили удобство работы с бактериями и вирусами, обусловленное их свойствами: коротким периодом генерации, быстрым накоплением популяций с огромным количеством особей, простотой культивирования и использования. На бактериальных объектах были открыты информационные, рибосомальные, транспортные РНК и установлен механизм синтеза белка. Д. Ледерберг и Э. Татум открыли у бактерий конъюгацию, В. Хейс - плазмиду, определяющую половую полярность бактерий. Ф. Жакобом и Э. Вольманом создано учение о плазмидах. Разработанная на модели кишечной палочки Ф. Жакобом и Ж. Моно концепция оперона стала универсальной концепцией генетического контроля экспрессии генов.

В 1972 году возникла и бурно развивается генная инженерия. Ключевое значение для ее возникновения и управления наследственностью имело обнаружение в 1970 г. Г. Теминым, С. Мизутани, Д. Балтимором у некоторых онкогенных вирусов фермента - обратной транскриптазы (ревертаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза). Это позволило получать на матрице информационной РНК копийный ДНК-ген и использовать его в генной инженерии. В биотехнологии, основанной на генной инженерии, широко используются бактериальные ферменты, плазмидные и вирусные векторы, а также бактерии как основные продуценты биологических продуктов.

Прокариоты (бактерии) имеют морфологически обособленные клеточные структуры, содержащие генетическую информацию, - ну- клеоиды. Нуклеоид состоит из одной свернутой в клубок хромосомы, которая свободно располагается в цитоплазме, но связана с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране. Поэтому бактериальная клетка в отличие от эукариот гаплоидна, т.е. содержит один набор генов.

В некоторых условиях клетки бактерий могут содержать совершенно идентичные по набору генов копии хромосомы, и бактерии остаются гаплоидными. В отличие от всех других организмов бактерии обладают уникальным свойством изменять массу своей ДНК, регулируя в зависимости от условий обитания содержание копий своих генов, эквивалентно массе 2, 4, 6, 8 хромосом. Это позволяет им регулировать скорость собственного размножения - одно из главных условий, обеспечивающих выживание бактерий в окружающей среде, а следовательно, и сохранение вида в природе.

Бактериальная хромосома представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК (кольцевую хромосому), содержащую гены, расположенные в линейном порядке. Поскольку длина хромосомы (у Е. coli около 1000 мкм) во много раз превышает длину бактерии (1,5-3,0 мкм в среднем), хромосома компактно упакована в суперспирализованной форме в виде 12-80 петель, связанных с сердцевинной структурой, представленной особым классом РНК - 4,5 S РНК. Геном (вся совокупность нуклеотидов, содержащихся в хромосоме у данного индивидуума) и генотип (вся совокупность индивидуальных генов у данного индивидуума) у бактерий не однозначны, но близки, так как большинство генов содержатся в хромосоме в единственном числе, в отличие от эукариот, содержащих до 30-50% повторяющихся последовательностей нуклеотидов в геноме. Поэтому размеры геномов у бактерий, вирусов, плазмид выражают либо в молекулярной массе, либо количеством нуклеотидных пар геномной нуклеиновой кислоты, либо количеством генов. Эти значения сопоставимы, так как в среднем каждый ген состоит из 1000 пар нуклеотидов, а масса одного нуклеотида ДНК - 500 дальтон. Так, хромосома Е. coli имеет молекулярную массу 2,8 х ю 9 дальтон, количество нуклеотидных пар 3,8 х Ю 6 и содержит 2500-3000 генов.

Хромосома бактерии состоит из двух типов генов: структурных (цистронов), кодирующих синтез определенной полипептидной цепи, и регуляторных (или акцепторных), регулирующих активность генов (регуляторы, операторы, промоторы, аттенуаторы, терминаторы идр.). Основной структурно-функциональной единицей хромосомы является оперон. Это группа структурных генов-цистронов, физически сцепленных друг с другом и с геном-оператором, который управляет их выражением. В свою очередь оперон или их группа находится под управлением одного гена-регулятора, что представляет более сложную структурно-функциональную единицу - регулон.

Гены в хромосоме располагаются линейно, поэтому можно изучать их последовательность и составлять хромосомную (генетическую) карту. Для этого изучают время переноса соответствующих генов при конъюгации бактерий. Локализацию генов на хромосоме определяют в минутах их переноса, в частности у кишечной палочки - от 0 до 100 мин.

В настоящее время основным методом изучения организации геномов живых организмов является секвенирование - определение последовательности расположения нуклеотидов в составе ДНК генов. Предварительно с помощью методики клонирования получают большое количество необходимых фрагментов ДНК. Уже полностью изучена нуклеотидная последовательность ДНК хромосом 20 важнейших бактерий (К pest is, Е. coli, Р. aeruginosa и др.).

Некоторые гены и группы генов хромосомы бактерий и плазмид бактерий относятся к транспонируемым генетическим элементам, т.е. генетическим структурам, способным в интактной форме перемещаться внутри данного генома или переходить от одного генома к другому, например, от плазмидного к бактериальному и наоборот. Транспонируемые генетические элементы представлены IS-элементами и транспозонами. IS-элементы, или вставочные последовательности (от англ, insertion sequence), имеют обычно небольшие размеры, не превышающие двух тысяч пар оснований. Они несут только один ген, кодирующий белок транспозазу, с помощью которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. Их обозначают: IS 1, IS2, IS3 и т.д. Транспозоны (Тп) представляют собой более крупные сегменты ДНК, фланкированные инвертированными IS-элементами. Помимо генов, обеспечивающих их транспозицию, они содержат другие различные гены. Внутри крупного транспозона могут находиться более мелкие транспозоны.

Транспозоны способны встраиваться в различные участки хромосомы или переходить от одного генома в другой. Очень часто транспозоны содержатся в составе R-плазмид. Транспозоны обнаружены в составе геномов бактерий, плазмид, вирусов, эукариот. Им принадлежит важная роль в изменчивости и эволюции живой материи. Обозначают транспозоны порядковым номером: Тп1, Тп2, ТпЗ и т.д.

Все известные плазмиды представляют собой небольшие, ковалентно-замкнутые в кольцо суперспирализованные молекулы двунитевой ДНК, размеры которых варьируют от 1,5 до 200 МД (от 1500 до 400 000 пар нуклеотидов). Чем больше молекулярная масса, тем сложнее набор генов и многообразнее функции плазмид. Плазмиды содержат гены саморепликации; гены, контролирующие самоперенос или мобилизацию на перенос; другие гены, определяющие специфические функции самой плазмиды. Например, F-плазмиды определяют донорские функции клетки и способность ее к конъюгации; Ent-плазмиды - синтез энтеротоксинов; биодеградативные плазмиды - разрушение различных органических и неорганических соединений.

Для плазмид характерны следующие свойства:

• саморегулируемая репликация;
• явление поверхностного исключения (механизм, который не позволяет проникнуть в клетку, уже содержащую плазмиду, другой, родственной ей, плазмиде);
• явление несовместимости (две близкородственные плазмиды не могут стабильно сосуществовать в одной клетке, одна из них подвергается удалению);
• контроль числа копий плазмиды на хромосому клетки (различают малокопийные - 1-4 копии и многокопийные - от 12 до 38 копий плазмиды);
• контроль стабильного сохранения плазмид в клетке-хозяине;
• контроль равномерного распределения дочерних плазмид в дочерние бактериальные клетки;
• способность к самопереносу (у конъюгативных плазмид);
• способность к мобилизации на перенос (у неконъюгативных плазмид);
• способность наделять клетку-хозяина дополнительными важными биологическими свойствами, способствующими выживанию бактерий и плазмид в природе.

Плазмиды распространяются среди бактерий двумя способами: по вертикали - путем передачи от родительской клетки дочерним клеткам в процессе клеточного деления бактерий; по горизонтали - путем переноса между клетками в популяции бактерий независимо от клеточного деления. Перенос плазмид между бактериальными клетками осуществляется по механизму самопереноса путем конъюгации, контролируемой tra-опероном плазмиды. В зависимости от наличия этого оперона плазмиды подразделяют на конъюгативные и неконъю- гативные. Возможны также другие механизмы переноса плазмид (мобилизации на перенос неконъюгативных плазмид с помощью конъю- гативных плазмид, трансформации, трансдукции).

Классификация плазмид основана на их уникальном свойстве несовместимости, т.е. неспособности родственных плазмид стабильно сосуществовать в одной клетке. Она проявляется после проникновения плазмиды в клетку, уже содержащую близкородственную ей плазмиду. Плазмиды, не совместимые друг с другом, но совместимые с другими, объединяются в одну Inc-группу. Например, у энтеробактерий обнаружены 39 Inc-групп плазмид. Плазмиды, относящиеся к одной Inc-группе, обладают многими общими признаками.

Плазмиды имеют важное медицинское значение, так как контролируют синтез различных факторов патогенности бактерий и их лекарственной резистентности. Общебиологическое значение плазмид состоит в том, что они являются уникальным средством самозащиты бактерий и благоприятствуют сохранению бактерий в природе.

Передача генетической информации потомству (вегетативная репликация ДНК) осуществляется у бактерий и плазмид по универсальному механизму - полуконсервативной репликацией ДНК. При этом дочерние клетки получают ДНК хромосомы, у которой одна нить родительская (консервативная), другая нить ДНК вновь синтезирована на ее матрице, что обеспечивает очень точную передачу генетической информации (наследственность). Вегетативная репликация ДНК у бактерий начинается со строго фиксированного сайта хромосомы (oriC), который распознается ферментами, инициирующими репликацию. Она носит полуконсервативный характер, идет одновременно в двух направлениях, заканчивается в строго фиксированной точке - terminus. Поскольку цепи ДНК антипараллельны (если одна нить начинается с 5-го конца, другая - с 3-го конца), а ДНК-полимераза Ш осуществляет синтез ДНК только в направлении 5-3, репликация происходит различно на каждой нити: на одной из расплетенных нитей («прямой», «лидерной») она идет непрерывно, а на другой («отстающей») ДНК-полимераза Ш должна возвращаться, чтобы наращивать нить тоже в направлении 5-3, прерывисто, через образование сегментов Оказаки длиной у бактерий около 1000 нуклеотидов.

Скорость репликации ДНК у Е. coli при 37 °С соответствует включению 2 х ю 3 пар нуклеотидов в 1 сек. В репликации ДНК участвует комплекс ферментов, образующих единую структуру - реплисому. Генетический контроль репликации ДНК осуществляет большая группа генов хромосомы.

Помимо вегетативного типа у бактерий имеются конъюгативный и репаративный типы репликации ДНК. Конъюгативная репликация происходит при конъюгативном способе обмена генетическим материалом и контролируется плазмидными генами (tra-оперон). При этом осуществляется достройка второй нити ДНК, комплементарной нити, передаваемой от донора реципиенту. Репаративная репликация служит механизмом устранения из ДНК структурных повреждений или происходит на заключительном этапе генетической рекомбинации. Она контролируется хромосомными и плазмидными генами.

Информация, содержащаяся в геноме бактерий, расшифровывается, материализуется и реализуется путем биосинтеза белка. Универсальности генетического кода соответствует универсальность его расшифровки и реализации (экспрессии). Однако биосинтез белка у бактерий имеет некоторые особенности на этапе транскрипции. Гены бактерий в отличие от генов эукариот и вирусов не содержат нитронов, поэтому у бактерий отсутствует процесс сплайсинга при синтезе мРНК. Сплайсинг РНК - процесс, при котором происходит вырезание интронов (некодирующих последовательностей у генов, имеющих интрон-экзонную структуру) из первичных РНК-транскриптов и сшивание экзонов, в результате которого образуется и затем транслируется зрелая мРНК. Отсутствие сплайсинга РНК у бактерий является естественным генетическим барьером в реализации генетической информации эукариот у бактерий (прокариот). Преодоление этого барьера привело к созданию генной инженерии на бактериальных объектах.

Генетическая информация реализуется микроорганизмами весьма «экономно», в соответствии с конкретными условиями их существования. «Работают» (экспрессируются) только гены, необходимые для обеспечения жизнеспособности клетки в данных условиях. Саморегуляция системы генетической информации обеспечивается наличием в ней помимо структурных генов, кодирующих белки и другие макромолекулы, особых последовательностей нуклеотидов (акцепторных или регуляторных генов), не имеющих кодирующих функций, но управляющих работой структурных генов. Как уже упоминалось, совокупность расположенных рядом структурных и регуляторных генов составляет оперон-единицу генетической регуляции. Классической моделью оперона является лактозный оперон. Рассмотрим на примере лактозного оперона кишечной палочки его устройство и способ регуляции активности структурных генов, кодирующих синтез ферментов, участвующих в усвоении лактозы.

Начинается оперон с «участка прикрепления белка-активатора» - продукта вышестоящего регулона (Сар-белка, без которого РНК-полимераза не может связаться с опероном и начать транскрипцию). Далее на хромосоме расположен промотор - участок распознавания РНК-полимеразой и прикрепления ее. Затем следует оператор - участок, с которым связывается особый тормозящий транскрипцию белок-регулятор. После оператора расположены последовательно структурные гены z, у, а, кодирующие соответственно синтез трех ферментов, участвующих в усвоении лактозы, - Я-галактозидазы, галактозидпермеазы, тиогалактозидтрансацетилазы. Заканчивается lac-оперон терминатором - небольшим участком ДНК, служащим стоп-сигналом, прекращающим продвижение РНК-полимеразы и транскрипцию оперона. Вне 1ас-оперона, на другом месте хромосомы находится особый ген-регулятор, кодирующий непрерывный синтез белка-регулятора. Когда в окружающей среде нет лактозы, белок- регулятор прикрепляется к оперону и как «шлагбаум» препятствует продвижению РНК-полимеразы от промотора к структурным генам, репрессируя транскрипцию и в итоге синтез ферментов. Лактоза, если она есть в питательной среде, связывается с белком-регулятором, ал- лостерически изменяет его конфигурацию, в результате чего белок-регулятор уже не может прикрепляться к оператору. В итоге «шлагбаум» открыт, РНК-полимераза транскрибирует структурные гены в соответствующие мРНК, на матрице которых синтезируются ферменты, усваивающие лактозу.

Таким образом, лактоза индуцирует синтез ферментов, нужных для ее усвоения. Такие ферменты называются адаптивными или индуктивными. Рассмотренный тип регуляции активности генов называется негативным, так как в основе его лежит репрессия оперона белком-регулятором. Есть два варианта этого типа регуляции: негативная индукция, которую мы рассмотрели, и негативная репрессия.

В последнем случае в исходном положении белок-регулятор не может связываться с оператором, и синтез ферментов идет, а при наличии эффектора, обычно конечного продукта действия анаболических ферментов, белок-регулятор под его воздействием связывается с оператором и синтез ферментов репрессируется. Кроме негативного известен еще позитивный тип генетической регуляции синтеза белка. Отличие его от негативного типа заключается в том, что белковый продукт гена-регулятора не запрещает транскрипцию оперона, а наоборот, активирует ее. Этот тип регуляции также встречается у бактерий в двух вариантах - позитивной индукции и позитивной репрессии. Например, ara-оперон, контролирующий усвоение арабинозы, работает у кишечной палочки по механизму позитивной индукции.

Проявление признаков живых организмов, контролируемых генотипом, зависит от условий существования организма. Совокупность признаков организма в конкретных условиях его существования называется фенотипом. В зависимости от условий микроорганизмы одного генотипа могут иметь различные фенотипы, так как реализуется различная часть генетической информации генотипа или реализация происходит в различном диапазоне нормы реакции генотипа. Смена фенотипов при смене условий существования организма называется модификацией. Иными словами, модификации - это фенотипические различия, вызываемые внешними факторами у одинаковых в наследственном отношении микроорганизмов.

Отличительными признаками модификации у бактерий являются (три «О»):

• определенность изменчивости (определенный фактор внешней среды, условий вызывает изменение строго определенного признака);
• общность изменений (изменения признака одновременно у всех или большинства особей генетически однородной популяции);
• обратимость изменений (изменения не наследуются, после прекращения действия внешнего фактора исчезают).

В некоторых случаях у бактерий наблюдаются так называемые длительные модификации, когда изменение признака сохраняется в нескольких поколениях после прекращения действия фактора. Это обусловлено тем, что при делении клеток передаются не только структуры генотипа, но и содержимое клетки, частично сохранившее остатки веществ, образовавшихся в предыдущих условиях.

Рассмотрим пример модификационной изменчивости бактерий. При посеве разведенной культуры бактерий Proteus vulgaris на питательный агар через сутки выросли колонии бактерий, каждая из которых окружена зоной роения. После пересева колоний на питательный агар с желчью все колонии выросли через сутки без роения. После пересева этих колоний на исходный питательный агар все выросшие колонии вновь имели зоны роения.

Изменения фенотипа протея на среде с желчью следует считать модификацией, так как присутствует все три отличительных признака: определенность изменчивости (связь отсутствия роения с фактором - желчью), общность изменчивости (изменения у всех колоний популяции), обратимость (при отсутствии желчи в питательной среде возврат бактерий к исходному фенотипу).

Возможность модификационной изменчивости бактерий следует постоянно учитывать в практической работе микробиологов. Для точной систематики и идентификации бактерий следует строго соблюдать стандартные (унифицированные) условия изучения свойств бактерий (стандартные питательные среды, тесты, реактивы, температуру и другие условия культивирования).

Первоисточником новых генов в природе являются мутации. Общепринятого определения мутации нет. Мутация от лат. mutatio - изменение генетических структур, имеющихся в клетке в данный момент, которое стабильно наследуется. Различают две группы мутаций: хромосомные аберрации, включающие 3 типа (изменение числа наборов хромосом, изменение числа отдельных хромосом, перестройки хромосом) и генные мутации. У бактерии могут быть мутации типа перестройки хромосом и генные мутации. При этом перестройки хромосом осуществляются путем делений (выпадения фрагмента хромосомы), инверсии (поворота участка хромосомы на 180°), транспозиций (вставок в какое-либо место хромосом небольших фрагментов ДНК, например, инсерционных сегментов или транспозонов). Генные мутации бывают односайтовые (в одном участке гена) или многосайтовые. Для появления мутации в гене достаточно точечного изменения одной пары нуклеотидов. По направлению мутации могут быть прямые или обратные. Прямые мутации вызывают изменения признаков организма дикого типа; обратные мутации сопровождаются реверсией к дикому типу. Восстановление исходного фенотипа в результате обратной мутации в ином участке гена или в другом гене является супрессорной мутацией. Мутация, в результате которой изменяются два и более признаков организма, называется плейотропной. Различают также спонтанные и индуцированные мутации. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно в том смысле, что они детерминированы, но мы не знаем конкретно их причин. Индуцированные мутации вызываются воздействием определенных мутагенных факторов. К ним относятся различные виды ионизирующих излучений, ультрафиолетовые лучи, химические мутагены.

Изменчивость по механизму мутаций характеризуют определенные отличительные признаки.

• 1. Наследственность.
• 2. Низкая частота (скорость) мутирования (у бактерий 1 х Ю 6 - 1 х Ю 7 , т.е. мутация у одной клетки из 1-10 млн). Способность давать мутации (мутабельность) подвержена влиянию генотипа. У бактерий мутабельность резко повышается, если они имеют особые гены - му- таторы. Например, у кишечной палочки обнаружены два гена-мутато- ра - mut Т, mut SI.
• 3. Ненаправленность изменчивости (т.е. неопределенность, неадекватность изменения признаков ввиду воздействующего фактора; один и тот же фактор вызывает различные мутации).

Экспериментами С. Лурия и М. Дельбрюка (флюктуационный тест), Ньюкомба (тест перераспределения) показано существование в исходных популяциях бактерий спонтанных мутантов, устойчивых к воздействующему фактору - фагу - еще до его воздействия. Методика отпечатков (реплик), разработанная Д. Ледербергом, позволила непосредственно выделять из популяции клеток мутанты до воздействия адекватного фактора или после воздействия мутагена - самые различные не адекватные по признакам.

Бактерии имеют особые системы репарации мутационных повреждений ДНК. Наиболее изучены системы: «фотореактивация», «темно- вая репарация», «репликативная репарация». «Фотореактивация» восстанавливает дефекты (тиминовые димеры) в ДНК, вызванные только ультрафиолетовыми лучами. При «темновой репарации» действует комплекс ферментов, восстанавливающий повреждение на одной нити ДНК путем вырезания поврежденного участка и синтеза на его месте второй нити комплементарного отрезка ДНК, замещающего дефект. Система «репликативной репарации» заменяет повреждения обеих нитей ДНК путем рекомбинации.

Другим механизмом наследственной изменчивости является обмен генетическим материалом между клетками популяций бактерий (по горизонтали). Он не создает новых элементарных признаков, но очень ускоряет создание организмов с новыми комбинациями признаков за счет перераспределения генов из разных геномов, что способствует быстрому приспособлению бактерий к условиям среды. Бактерии способны к широкому генетическому обмену между различными видами и родами, а также с бактериофагами и плазмидами. У бактерий выявлены три основные формы обмена генетическим материалом: трансформация, трансдукция, конъюгация (рис. 3.2, 3.3). Они различаются способом передачи генетического материала.

Трансформация характеризуется передачей клетке-реципиенту некоторых генов донора с помощью свободной ДНК, выделенной из генома донора. Трансформация может быть спонтанной или индуцированной. Спонтанная трансформация в естественных условиях проявляется в появлении рекомбинантов при смешивании генетически различающихся клеток. Она протекает за счет ДНК, выделяющейся клетками в окружающую среду при их лизисе или в результате активного выделения ДНК жизнеспособными клетками-донорами. Индуцированная (искусственная) трансформация происходит при добавлении к культуре бактерий очищенной ДНК, полученной из бакте- рий-доноров. Для успешной трансформации необходим ряд условий, относящихся к ДНК и бактериям-реципиентам. ДНК должна быть двухцепочечной, иметь фрагменты 3-5 х Ю 6 дальтон, быть частично или полностью гомологичной ДНК реципиента. Клетки реципиента должны обладать компетентностью, т.е. восприимчивостью, что имеет место только в определенный период жизненного цикла, обусловлено выделением клеткой особого белка «фактора компетентности» и специфическим изменением проницаемости клеточной стенки и мембраны. Процесс трансформации состоит из нескольких этапов: связывания ДНК на поверхности компетентного реципиента с «фактором компетентности», проникновения ДНК путем «втаскивания» в клетку, включения ДНК в хромосому бактерии-реципиента путем рекомбинации, экспрессии переданных генов. Эффективность генетической трансформации во много раз повышается, если смесь ДНК и трансформируемых клеток подвергнуть обработке электрическим импульсом (метод электротрансформации). В естественных условиях эффективность трансформации менее существенна, чем других форм передачи генетического материала. Клетки бактерий имеют механизм защиты генома от чужеродной ДНК - особые системы модификации и рестрикции. Эти системы защищают свою ДНК путем модификации (чаще путем ее метилирования) и разрушают чужеродную ДНК с помощью особых ферментов - рестрикционных эндонуклеаз. Частным вариантом трансформации является трансфекция, когда в клетку-реципиент, лишенную клеточной стенки, вносят ДНК бактериофага или плазмид.

Трансдукция - перенос генетического материала от клетки-донора клетке-реципиенту с помощью бактериофагов. Различают общую (неспецифическую) и специфическую трансдукцию. Механизм общей трансдукции состоит в том, что в процессе внутриклеточного размножения вирулентного фага в его головку может быть случайно включен вместо фаговой ДНК фрагмент бактериальной ДНК, равной подлине фаговой. Так возникают дефектные фаги, у которых вместо собственной геномной ДНК содержится фрагмент ДНК бактерии-донора. Такие фаги сохраняют инфекционные свойства. Они адсорбируются на бактериальной клетке, вводят в нее ДНК, но при этом размножения фага не происходит. В случае генетической рекомбинации привнесенного фагом фрагмента ДНК донора с хромосомой клетки- реципиента новый признак наследственно закрепляется. Таким образом, при общей трансдукции фаг является только пассивным переносчиком генетического материала.

Специфическую трансдукцию отличает перенос строго определенного фрагмента ДНК бактерии-донора умеренными бактериофагами. Как известно, умеренными называют такие бактериофаги, которые могут интегрировать в хромосому клетки бактерий, вызывая ее лизогенизацию. Интегрированный в хромосому бактерии-донора умеренный фаг (профаг) в определенных условиях выходит из хромосомы, «прихватывая» ближайшие участки ДНК хромосомы бактерии и оставляя часть своего генома. Возникает дефектный умеренный фаг, включивший в свой геном бактериальные гены бактерии-донора. Далее трансдуцируюший фаг вносит свою ДНК в клетку бактерии-реципиента, где она вместе с фрагментом ДНК бактерии-донора интегрируется в состав хромосомы реципиента. В последующем фаг может выйти из хромосомы реципиента, но переданные им гены бактерии- донора остаются у реципиента. Примером может служить умеренный бактериофаг лямбда (X), который всегда переносит оперон gal или oneрон bio. Специфическая и общая трансдукция низкочастотны (10 -4 - 10 -7 на 1 частицу фага). Частным вариантом специфической трансдук- ции является фаговая или лизогенная конверсия. Трансдуцирующий фаг, интегрируясь в хромосому реципиента, вызывает лизогенизацию бактерии и передает гены новых признаков, например, токсинообра- зования, дифтерийным бактериям. Однако гены, контролирующие новый признак, постоянно включены в геном таких трансдуциру- ющих фагов. Появление этих генов не связано с предварительным размножением фага на токсигенных донорах. Вероятно, фаг включил в геном эти гены на более ранних этапах своей эволюции. Такие трансдуцирующие фаги недефектны и вызывают фаговую конверсию с очень высокой частотой.

Конъюгация характеризуется переносом генетического материала путем непосредственного контакта между клетками. Этот процесс по- лярен - генетический материал передается только от бактерий-доно- ров к бактериям-реципиентам. Донорская функция клетки и процесс конъюгации контролируются генами конъюгационного переноса (tra- оперон), локализованными в конъюгативных плазмидах. Среди многих конъюгативных плазмид имеется плазмида F, контролирующая только указанные функции. В автономном, внехромосомном состоянии она обеспечивает донорский тип клетки F+ (мужская), образование полых ворсинок (F-пили) и свой собственный перенос в F- (женские) клетки реципиента. При этом хромосома донора не передается, а реципиенты, получившие плазмиду F, приобретают донорский тип F+. При интеграции плазмиды F в хромосому бактерии-хозяина образуются Hfr (high frequency of recombination) - штаммы бактерий с высокой частотой передачи хромосомных генов. Однако плазмида F обычно не переходит в клетку реципиента, так как находится на конце хромосомы, противоположном тому, с которого начинается ее переход.

Переход хромосомы через конъюгационный мостик между клетками через канал F-пили сопряжен с ее репликацией. При этом через мостик проходит только одна нить ДНК хромосомы, на которой в клетке реципиента синтезируется комплементарная вторая нить, и далее под контролем генов рекомбинации (гес А) хромосомы реципиента происходит интеграция переданного фрагмента ДНК в хромосому реципиента. Плазмида F может ревертировать у Hfr-штаммов в исходное внехромосомное состояние, захватив прилегающий участок бактериальной хромосомы. Таким способом формируется плазмида F’ (F-прим), несущая часть хромосомных генов бактерии-хозяина, например, плазмида F’ lac. Перенос генов донора в клетки реципиентов посредством плазмид F’ называется сексдукцией. При этом плазмида F’ переносит свой геном, содержащий и некоторые гены донора, с высокой частотой, а хромосома бактерии-донора не передается.

Перенос других видов конъюгативных плазмид (R, Ent, Col и др.) также происходит с высокой частотой. Следует отметить, что эффективный перенос плазмид путем конъюгации не знает «родственных» барьеров и происходит между бактериями различных видов и родов.

При любой форме обмена генетическим материалом заключительным этапом является рекомбинация между полученной ДНК и хромосомой клетки-реципиента. При переносе одной нити ДНК вначале происходит достраивание комплементарной ей нитью. Рекомбинируют между собой только двунитевые ДНК. Известны общая рекомбинация, сайт-специфическая рекомбинация и рекомбинация, контролируемая транспонируемыми элементами.

Общая рекомбинация происходит между гомологичными ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация обусловлена наличием специфических участков у рекомбинируемых молекул ДНК, например, хромосомы Е. coli и умеренного бактериофага лямбда. Общая и сайт-специфическая рекомбинации контролируются геном гее А. Рекомбинации, осуществляемые транспонируемыми элементами, также сайт-специфичны и определяются особыми нуклеотидными последовательностями, однако не зависят от гее А гена. Ведущая роль в процессах рекомбинации у бактерий принадлежит гену гее А. Его продукт - белок Rec А (молекулярная масса 38 кД) обладает уникальными функциями: прочно связывается с одиночными нитями ДНК; способствует высвобождению разорванной нити из двойной спирали ДНК; удерживает вместе одиночную нить ДНК и двойную спираль ДНК; обладает свойством ДНК-зависимой АТФ-азы. Ген гес А участвует не только в процессе рекомбинации. Его продукт необходим для пострепликативной репарации, индукции профага, клеточного деления и других важных функций бактерий. Рецессивные мутации в таком гене отражаются на всех этих функциях, поэтому они получили название SOS-функций, а их совокупность представляет единую SOS-систему. Выражение любой SOS-функции зависит от активности продукта гена гес А. SOS-система срабатывает после любых повреждающих воздействий на ДНК. Поэтому ген гес А имеет основное значение в самозащите генетической системы бактерий.

Применение методов генетики для изучения генома бактерий позволило создать геносистематику бактерий. На ее основе существенно уточнена действующая классификация бактерий и созданы предпосылки разработки естественной систематики и классификации. В интересах систематики используют ряд методов. Метод гибридизации ДНК-ДНК (выявления уровня гомологии ДНК). Считается, что показатель 60-100% гомологии ДНК указывает на родство на уровне вида. Однако общепринятых критериев нет. Метод гибридизации ДНК с рРНК выявляет генетические связи между участком ДНК, контролирующим синтез рРНК, и нуклеотидами рРНК. Цистроны, ответственные за синтез рРНК, консервативны и позволяют выявить родственные связи на уровне рода, семейства. Наиболее надежным является метод секвенирования ДНК. Этот метод выявляет последовательность нуклеотидов в отдельных фрагментах ДНК или всей ДНК хромосомы. Лучшим объектом исследования (наиболее консервативным) является участок ДНК, контролирующий синтез 16S рибосомальной РНК бактерий. ДНК этого фрагмента клонируют, затем секвенируют. Метод секвенирования ДНК позволяет выявить родство бактерий на уровне царства, класса, семейства, рода, но недостаточно чувствителен для установления вида. Этот метод позволяет выявлять эволюционные связи бактерий и является основным в геносистематике. У наиболее важных бактерий изучена методом секвенирования полная последовательность нуклеотидов ДНК хромосомы (кишечная палочка, синегнойная палочка и др.).

Раскрыт генетический механизм весьма важной для медицины проблемы приобретенной лекарственной устойчивости бактерий.

Установлено, что основное значение в быстром формировании устойчивости бактерий к антибиотикам имеют R-плазмиды, несущие гены устойчивости к 1-10 антибиотикам в любых сочетаниях. Они могут передавать гены антибиотикорезистентности чувствительным бактериям за несколько минут, превращая в устойчивую всю популяцию бактерий в организме. До сих пор нет эффективных средств удаления R-плазмид или блокады их передачи. Пока реальным достижением является применение препаратов, блокирующих активность ферментов, разрушающих антибиотики, которые контролируются R-плазмидами. Например, для инактивации бета-лактамазы используют клавулано- вую кислоту, сульбактам, тазобактам в сочетании с антибиотиками бета-лактамной группы.

Установлен генетический контроль факторов патогенности бактерий. Показана возможность локализации этих генов в геномах бактерий, бактериофагов, плазмид. Выявлены механизмы формирования патогенных штаммов среди условно-патогенных бактерий. Эти сведения позволяют выявлять патогенные бактерии молекулярно-биологическими методами и целенаправленно получать авирулентные вакцинные штаммы микроорганизмов.

Крупным достижением генетики является разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), отмеченного Нобелевской премией (Мюллис К., 1993). На основе ПЦР создана принципиально новая универсальная система индикации микроорганизмов и диагностики инфекционных заболеваний - геноиндикация. Метод ПЦР позволяет амплифицировать («размножить», клонировать) in vitro определенные участки ДНК, за 2-4 ч получить миллионы копий этой ДНК. Сущность метода ПЦР составляет многократный циклический процесс, попеременно включающий в каждом цикле три этапа - тепловую денатурацию ДНК (плавление), ее отжиг (присоединение синтетических олигонуклеотидных праймеров), синтез (достраивание второй цепи ДНК термостабильной ДНК-полимеразой). Смена этих этапов происходит в результате изменения температуры реакционной смеси в специальном приборе амплификаторе (термоциклере). Денатурация исходной и последующих копий ДНК, ведущая к разделению ДНК на две одиночные цепи, происходит при 90-95 °С в течение 40- 50 сек. Отжиг (присоединение праймеров) происходит при температуре 40- 65 °С. Праймеры - синтетические олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидов) - присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени, фланкируя искомый специфический фрагмент ДНК. Праймеры подбирают так, чтобы они ограничивали искомый фрагмент и были комплементарны противоположным цепям ДНК; при этом один праймер находится на одной цепи, другой - на противоположной. Синтез (элонгация) - достраивание второй цепи Д Н К происходит при 72 °С с участием Tag-ДНК-полимеразы. Достраивание второй нити ДНК идет с 5"-конца к З"-концу каждой нити ДНК, т.е. в противоположных направлениях. В результате первого цикла образуются две копии участка ДНК, ограниченного праймером. Длительность цикла составляет в зависимости от вида термоциклера 2-2 мин или 30-40 сек. В результате каждого последующего цикла количество синтезируемых копий удваивается в геометрической прогрессии (рис. 3.4). Обычно ПЦР включает 20-30 циклов, что обеспечивает синтез 1 млн копий искомого фрагмента ДНК.

Рис. 3.4.

Для детекции продуктов ПЦР применяется электрофорез или другие системы детекции.

ПЦР адаптирована для выявления большинства микроорганизмов, имеющих медицинское значение. Она позволяет быстро обнаружить искомый микроорганизм непосредственно в исследуемом материале без выявления чистой культуры, имеет высокую чувствительность (1 х Ю 1 - 1 х Ю 3 микроорганизмов в 1 г материала). ПЦР нашла широкое применение для обнаружения трудно культивируемых и медленно растущих микроорганизмов (вирусов, хламидий, риккетсий, микоплазм, спирохет, микобактерий).

Оглавление темы "Оценка роста бактерий. Спорообразование бактериями. Генетика бактерий.":
1. Двухфазный рост бактерий. Диауксия. Рост без деления. Оценка роста бактерий. Количественная оценка роста бактерий.
2. Факторы влияющие на рост бактерий. Культуральные среды для роста бактерий. Простые и сложные культуральные среды. Твердые и жидкие культуральные среды.
3. Температура роста бактерий. Мезофильные бактерии. Термофильные бактерии. Психрофильные бактерии. Аэрация бактерий.
4. Величина рН необходимая для роста бактерий. Пигменты бактерий. Виды пигментов. Функции пигментов бактерий.
5. Спорообразование бактериями. Споры бактерий. Спорангии. Эндоспоры. Экзоспоры.
6. Морфология споры бактерий. Строение споры бактерий. Структура споры бактерий.
7. Споруляция бактерий. Стадии споруляции у бактерий. Расположение спор у бактерий.
8. Прорастание спор бактерий. Активация споры. Покоящиеся (некультивируемые) формы бактерий.

10. Внехромосомные факторы наследственности бактерий. Плазмиды бактерии. Виды плазмид. Функции плазмид бактерий.

В наши дни приоритетным направлением естествознания можно считать молекулярную биологию. Она тесно связана с микробиологией и в известном смысле является её детищем, так как в качестве основных моделей использует бактерии и вирусы, а одно из основных направлений молекулярной биологии - молекулярная генетика - долгое время являлась не чем иным, как генетикой бактерий и бактериофагов.

Изучение генетики бактерий имеет также и несомненный прикладной интерес, например в плане установления механизмов передачи патогенных свойств и устойчивости к лекарственным препаратам.

Бактерии - удобная модель для генетических исследований . Их отличает: относительная простота строения генома, позволяющая выявлять мутанты с частотой 10 -9 и ниже; гаплоидность, исключающая явление доминантности; половая дифференциация в виде донорских и реципиентных клеток; наличие обособленных, и интегрированных фрагментов ДНК (плазмид, транспозонов и т.д.); лёгкость культивирования и возможность получения популяций, содержащих миллиарды микробных тел.

Как и у других организмов, совокупность генов бактериальной клетки - геном - определяет её свойства и признаки (генотип ). Фенотип бактериальной клетки - результат взаимодействий между бактерией и окружающей средой - также контролирует геном (так как сами признаки закодированы в бактериальных генах).

Генетический материал бактерий

Ядерные структуры бактерий имеют характерное строение, отличающее их от ядер эукарио-тических клеток; их образуют так называемые хроматиновые тельца, или нуклеоиды, лишённые оболочки и включающие в себя почти всю ДНК бактерии.

Ядерные структуры можно наблюдать в фазово-контрастный микроскоп, где они выглядят как менее плотные участки цитоплазмы. Для их выявления в фиксированных мазках предложена реакция Фёльгена-Россенбёка.

В растущих бактериальных клетках нуклеоиды активно делятся, их количество иногда достигает 2-4.

Прокариотический геном

У бактерий обычно имеется одна замкнутая кольцевидная хромосома , содержащая до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, то есть бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы обычно сопровождается её делением.

Некоторые виды (например, Brucella melitensis) стабильно содержат две кольцевые хромосомы , другие (Leptospira interrogans) - одну кольцевую хромосому и одну большую плазмиду, третьи - одну линейную хромосому (Streptomyces ambofaciens), то есть обладают сложными геномами.

Бактериальная хромосома содержит до 5*10 6 пар оснований. Для сравнения: геном человека составляет 2,9*10 9 пар оснований. Длина бактериальной хромосомы в развёрнутом состоянии составляет около 1 мм (Escherichia coli).

Некоторые бактерии содержат внехромосомные молекулы ДНК (плазмиды ) и мобильные элементы (либо плазмидные, либо хромосомные).

Бактерии – прокариотические микроорганизмы, генетический материал которых в основном представлен единственной кольцевой двухцепочечной ДНК, называемой генетиками хромосомой. В относительно редких случаях хромосома представлена линейной молекулой ДНК.

Размер этой ДНК намного превышает размер самой бактериальной клетки. Так, например, у E. coli протяженность хромосомной ДНК равна 1300 мкм (1,3 мм – 4,6 х 10 6 п.н.), а размер клетки 1,1-1,5 х 2,0-6,0 мкм. Причем ДНК не заполняет всю клетку, а содержится только в ограниченной области, составляющей, весьма приблизительно, одну треть объема клетки.

Рис.1. Бактериальный геном и схема уровней его компактизации.

Отсюда следует, что ДНК существует в клетке в высокоупорядоченном (сконденсированном) состоянии в виде компактной структуры. Эта структура, отдаленно напоминая ядра эукариот, получила название нуклеоид и видна в микроскопе только после специфичных для ДНК окрасок (рис.1). В электронном микроскопе она выглядит как образование, состоящее из многочисленных петель, отходящих от плотной центральной области. Образование большого числа (до 140 на геном) петель, называемых доменами , является одним из уровней компактизации ДНК. Каждый домен закреплен у основания молекулой РНК и состоит примерно из 40 т.п.н. ДНК петель находится не в виде свободно вытянутого дуплекса, а имеет второй уровень компактизации за счет скручивания в сверхспиральные образования с помощью связи с белками HLP.

Эти белки имеют небольшой размер, обладают сильноосновными свойствами и прочно связываются с ДНК. По аминокислотному составу они напоминают гистоны эукариот.

Нуклеоид не отделен от цитоплазмы ядерной мембраной и прикреплен к мезосомам – специфическим впячиваниям цитоплазматической мембраны внутрь клетки. Связь ДНК со специфическим участком мембраны необходима для функционирования генома.

Кольцевая молекула ДНК бактерий (хромосома) представляет самореплицирующуюся генетическую молекулу – репликон . Репликация начинается с точки инициации репликации (ori – orign) , локализующейся, как правило, в участке прикрепления ДНК к мембране. От точки инициации репликация происходит последовательно, двунаправленно, по полуконсервативному механизму. Заканчивается репликация в районе терминации репликации (ter) , расположенном на участке кольцевой ДНК, противоположном точке начала репликации (рис.2).

Рис. 3. Распределение дочерних копий ДНК и деление клетки бактерий.

Число хромосом в одной клетке бактерий зависит от стадии развития и физиологических условий роста культуры. В логарифмической стадии роста у E. coli на 1 нуклеоид приходится 2,8 ДНК эквивалентов одного генома, вследствие замедленной сегрегации двух дочерних хромосом, или реинициации новых циклов репликации ДНК еще до деления клетки (рис.4).

Рис.4. Число хромосом в клетке в стационарной (А) и логарифмической (Б) стадиях роста культуры.

У некоторых бактерий клетки в норме содержат не одну, а много хромосом. Они могут формировать один или несколько нуклеоидов. Также наблюдается зависимость содержания ДНК в клетке от ее размеров, хотя это не означает соответствующего изменения объема генетической информации.

Для бактериальной ДНК характерна высокая плотность генов (1 ген на 1тпн). ДНК, кодирующая белки, составляет около 85-90% всей ДНК. Средний размер ДНК-последовательностей между генами – только 110-125 п.н. Некодирующая бактериальная ДНК занимает менее 1%, и она обычно представлена в виде транспозонов. Так, в ДНК штамма Escherichia coli K12 линии MG 1655 найдена 41 копия различных транспозонов (IS), которые участвуют в процессах внедрения и исключения плазмид. Многие фаги, исключаясь из генома бактерии не полностью, оставляют там в качестве следа некоторые свои гены. Эти остатки, не способные к самостоятельному перемещению и развитию, называют "криптическими" фагами.

Интроны встречаются в бактериальных геномах крайне редко. Имеются случаи перекрывания генов, где один ген находится внутри другого на той же нити ДНК. Для бактериальных геномов характерны опероны: у Е. coli 27% предсказанных транскрипционных единиц являются оперонами.

В клетке бактерий могут содержаться и другие репликоны, способные существовать отдельно от бактериальной хромосомы. Их называют плазмидами . Плазмиды представляют собой кольцевые (у некоторых видов линейные) молекулы двухцепочечной ДНК различных размеров от 1000 п.н. до почти трети величины самой бактериальной хромосомы. Количество и спектр плазмид в клетках бактерий может варьировать. Часто наблюдаются различия по спектру плазмид даже между клетками разных штаммов одного и того же вида бактерий. Некоторые плазмиды могут встраиваться в бактериальную хромосому, составляя при этом часть репликона бактерии, и могут вновь исключаться из нее, восстанавливая форму автономного репликона. Такие плазмиды называют эписомами .

В генетический материал бактерий могут быть включены и профаги.

Явление наследственности связано со спецификой молекулы ДНК, которая программирует процессы индивидуального развития особей бактерий. У высших растительных и животных организмов вся генетическая информация заложена в ядре, содержащем полный набор хромосом. Аналог ядра у бактерий представлен нуклеотидом, состоящим из одной уложенной или развернутой молекулы ДНК. Генетический материал бактерий представлен ДНК, в молекулах которой закодирована информация о структуре клеточных белков.

Двунитевая молекула ДНК-хромосомы бактерии кишечной палочки состоит из 1,7х107 нуклеотидных пар. Ее молекулярная масса составляет примерно 3% сухой массы клетки бактерии. Единицей наследственности является ген, представляющий собой участок ДНК, в котором зашифрована последовательность аминокислот в полипептидной цепи, характеризующий отдельный признак особи. В отличии от растений и животных бактерии преимущественно являются гаплоидными – содержат одинарный набор генов и совмещают функции гаметы и особи.

Состав нуклеотида бактерий

Синтез каждого фермента, или более точно полипептидной цепи контролируется отдельным геном генома. Если в геноме бактерии отсутствует ген данного фермента, этот фермент не может быть синтезирован. ДНК представляет собой длинный полимер – полинуклеотид. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания – аденина, гуанина, цитозина или тимина и остатка сахара дезоксирибозы и фосфатной группы, с помощью которых нуклеотиды соединяются между собой.

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД

• ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД – составляет особая последовательность нуклеотидов на определенном участке ДНК. Последовательность оснований в ДНК характеризует собой структурную единицу – кодон, который кодирует каждую из 20 аминокислот, входящих в состав белков.

ГЕНОТИП

• ГЕНОТИП – это комплекс генов, наследственно переданный особи материнской клеткой. Комплекс внешних и внутренних признаков бактерий, таких как форма, размеры, окраска, химический состав, биохимические и микроскопические особенности соответствуют фенотипу, то есть внешнему проявлению генотипа.

Транскрипция

• Процесс синтеза белка, закодированный молекулой ДНК, осуществляется в несколько этапов и требует участия трех типов РНК:

• Информационной (матричной) – и-РНК, транспортной – т-РНК, рибосомальной – р-РНК. Информационная РНК образуется припомощи специфического фермента РНК-полимеразы на матрице молекулы ДНК. При этом генетическая информация, определяемая типом последовательности чередования нуклеотидов, копируется в молекуле и-РНК.

Рибосомы бактерий

• Информационная РНК направляется к рибосомам, находящимся в цитоплазме, которые представляют собой рибонуклеопротеиды, содержащие 63% РНК и 37% белка.

• Рибосомы бактерий содержат три типа собственной рибосомальной РНК 5S, 16S, 26S. Кроме РНК субъединицы рибосом имеют индивидуальные белки. Предполагают, что белки выполняют функции формирования структуры рибосом и центров связывания активизированных аминокислот, а также обеспечивают правильность считывания матрицы.

Трансляция

Перевод четырехбуквенного (А,Т,Г,Ц) языка нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) на язык протеинов называется трансляцией. Реализация наследственной информации происходит в определенных условиях внешней среды. Различия в условиях среды накладывают свой отпечаток на развитие особей бактерий. Поэтому развитие бактерий необходимо рассматривать как следствие действий двух важнейших факторов – действия генотипа, влияния на особь факторов внешней среды.

Гетероморфизм

• Под влиянием физических, химических и биологических воздействий некоторые микроорганизмы могут изменять свои морфологические признаки, принимая формы больших шаров, утолщенных нитей, колбовидных образований, ветвлений и т.д. Явление морфологических изменений у микробов Н.Ф.Гамалея назвал гетероморфизмом .

Диссоциация

Гетероморфизм легко возникает под влиянием солей лития, а также фага, кофеина, сульфаниламидов, антибиотиков, различных излучений, действия магнитных полей и других факторов. Любое изменение морфологических признаков, как правило, сопровождается изменением и физиологических свойств. Например, при посеве на плотную питательную среду чистой культуры образуются колонии двух основных типов: гладкие – S –формы и шероховатые R-формы. Такого рода изменчивость получила название диссоциация.

Генетическая изменчивость микроорганизмов

• Изменчивость бактерий затрагивает и их потребность в метаболитах. Под влиянием антибиотиков, химических веществ, ультрафиолетового излучения у некоторых микробов появляется потребность в витаминах, аминокислотах, факторах роста, в которых не нуждались исходные штаммы.

• Таким образом, в отличие от исходных прототрофов эти микроорганизмы превращаются в ауксотрофов.

Ненаследственная фенотипическая изменчивость

• Под действием некоторых веществ могут изменяться ферментативные свойства бактерий. Еще более важным моментом является то, что под влиянием различных факторов изменяется степень патогенности у болезнетворных микробов.

• Изменчивость микроорганизмов, возникающая под действием факторов внешней или внутренней среды, которая не сопровождается изменением структуры генотипа называется ненаследственной фенотипической изменчивостью.

Аттенуация

• В процессе снижения степени патогенности микроорганизмов – аттенуации происходят наследственные генотипические изменения химического состава бактерий. У микобактерий туберкулеза уменьшается содержание липидов, у возбудителя чумы – белка, у туляремийных бактерий и бруцелл – снижение способности липидов к комплексообразованию.

L-формы бактерий

• При воздействии пенициллином, химическими веществами или иммунными сыворотками на стафилококки, микобактерии туберкулеза и многие другие бактерии, возникают L-формы бактерий у которых нарушается синтез клеточной стенки. Микробная клетка превращается в большой шар с вакуолями, гранулами, зернистостью.

МУТАЦИИ

• При необратимой утрате определенных звеньев биосинтеза клеточной стенки, у бактерий наблюдается наследственная генотипическая изменчивость – мутационная изменчивость.

• Нуклеоидная мутация – происходящая в нуклеоиде.

• Цитоплазматическая мутация – в ДНК цитоплазмы.

Происхождение мутации

• Спонтанные, образующиеся под воздействием внешних факторов без вмешательства экспериментатора.

• Индуцированные, возникающие в следствии обработки микробной популяции мутагенными факторами.

По механизму действия мутации

• 1. Точечные или мелкие, при которых в результате замены, вставки или выпадения одной пары азотистых оснований ДНК внутри самого гена изменяется генетический признак бактериальной клетки. Наблюдается спонтанная или индуцированная реверсия, т.е. восстановление утраченного или утрата приобретенного признака.

По механизму действия мутации

• 2. Крупные или множественные мутации, при которых наблюдается, в основном, летальный исход.

• 3. Супрессорные мутации – это эффекты приобретения или утраты признака, непосредственно не связанного с действием мутагена на структурный ген, ответственный за этот признак. Закономерный исход супрессорных мутаций – восстановление исходного генетического статуса.

Генетические рекомбинации

Суть явления – в реципиентную клетку попадает фрагмент экзогенной ДНК бактерии-донора, который взаимодействует с цельной хромосомой реципиента, в результате чего происходит рекомбинация (перераспределение) генетического материала с образованием рекомбинанта, имеющего признаки обоих родителей. Его хромосома состоит из двух хромосом - реципиента с фрагментами донора.

Фертильность

• Для осуществления возможности скрещивания донор должен обладать свойствами фертильности (плодовитости).

• Рекомбинация произойдет при наличии у реципиента рекомбинационных генов, а также при отсутствии факторов ограничения экспрессии чужеродной ДНК.

ТРАНСФОРМАЦИЯ

• Это передача генетической информации, путем введения в клетку реципиента изолированной ДНК бактерии-донора. Трансформация эффективна в пределах одного вида.

• Межвидовая трансформация получена у бактерии родов Neisseria, Bacillus, Streptoccocus.

ТРАНСДУКЦИЯ

• Перенос генетической информации от донора реципиенту посредством умеренных бактериофагов, которые в отличие от вирулентных, не всегда вызывают лизис бактериальной клетки.

• В трансдукции принимают участие бактерия-донор, трансдуцирующий фаг и бактерия-реципиент.

• Различают три вида трансдукции:

Общая(неспецифическая) и специфическая трансдукция

• Неспецифическая - передается любой участок хромосомы бактерий или несколько участков, определяющих целый ряд наследуемых признаков.

• Специфическая – осуществляется группой фагов, которые способны трансдуцировать гены, расположенные рядом с местом включения генома фага в нуклеоид бактерий при ее лизогении.

Абортивная трансдукция

• Когда внесенный фагом фрагмент нуклеоида не включается в нуклеоид реципиента и находится в цитоплазме, а при делении передается только одной клетке. У второй дочерней клетки остается генетический аппарат реципиента. Это проявляется в антигенной конверсии, влекущей за собой изменение антигенной структуры.

КОНЪЮГАЦИЯ

• Это половой путь передачи генетического материала при непосредственном контакте клеток донора и реципиента. Необходимое условие – наличие у донора фактора фертильности. У Гр.- бактерий есть этот фактор. Скрещивание F + донора и F- реципиента сопровождается плодовитостью, F- х F- бесплодностью.

Конъюгативная плазмида

• Это внехромосомная генетическая структура бактерий, представляющая замкнутое кольцо двунитевой ДНК, находящейся в цитоплазме в автономном состоянии и ориентирующаяся на передачу хромосомы, будучи с нею в интегрированном состоянии.

ПЛАЗМИДЫ

• Плазмиды несут необязательные для клетки-хозяина гены и придают бактериям дополнительные свойства, которые могут им обеспечить преимущества по сравнению с бактериями, не имеющими плазмид.

• Плазмиды несут факторы фертильности, резистентности, токсигенности, гемолизиса.

Фактор передачи

• У конъюгативных плазмид в структуре есть генетический элемент трансмиссивности, обеспечивающий передачу генетической информации.

• Плазмиды, не имеющие такой частицы и неспособные к самопередаче незываются неконъюгативными.

• К нам относятся туберкулоцины, пестицины, вибриоцины.

• Плазмиды – это очень удобная модель для генной инженерии.

Генетика микроорганизмов . Генотипическая изменчивостьРеферат >> Биология

И передается при конъюгации в клетки бактерий -реципиентов. Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra-опероном... название «транскапсидация». Практическое значение учения о генетике микроорганизмов и генная инженерия в медицинской микробиологии...

Генетика микроорганизмов . Фенотипическая и генотипическая изменчивость

Реферат >> Биология

... генетического материала от одной бактерии к другой при непосредственном контакте клетки. Клетки, передающие генетический материал , ... фрагмента донора. Практическое применение генетики микроорганизмов Достижения генетики широко применяются в народном хозяйстве...

Генетика и генетический код

Реферат >> Биология

К самоудвоению генетического материала и устойчивому сохранению... микроорганизмов - продуцентов антибиотиков, аминокислот. В последнее десятилетие возникло новое направление в молекулярной генетике ... бактерии и ввести его в генетический аппарат другой бактерии ...

ЛФ, ФИУ, ПФ. Занятие № 6

А. Основные положения

Организация генетического материала у бактерий.

Наследственная информация бактерий хранится в ДНК, которая в прокариотической клетке является циркулярно замкнутой, двух цепочечной, суперспирализованной и представлена двумя типами молекул: большая – нуклеоид, где закодированы жизненно важные признаки, и малые – внехромосомные факторы наследственности (плазмиды, транспозоны, IS-последовательности, и умеренные бактериофаги), в которых закодированы дополнительные признаки.

Внехромосомные факторы наследственности и их встраивание их в нуклеоид.

Плазмиды могут, подобно нуклеоиду, самореплицироваться и поэтому относятся к автономным факторам наследственности (в отличие от остальных – неавтономных, которые способны реплицироваться лишь в составе нуклеоида или плазмиды), кроме того, плазмиды, как и умеренные фаги, могут встраиваться в нуклеоид только в гомологичных участках, в отличие от транспозонов и IS-последовательностей, способных встраиваться в нуклеоид в любых его участках.

Плазмиды.

Плазмиды выполняют в бактериальной клетке две возможные функции – регуляторную (содержа в себя дупликаты некоторых нуклеоидных генов) и кодирующую (неся гены, которых в нуклеоиде нет), могут существовать в двух состояниях (автономном, т.е. вне нуклеоида, и интегрированном в нуклеоид), а в зависимости от содержания в них tra-оперона – быть конъюгативными (если этот оперон содержится в данной плазмиде) и неконъгативными.

Функции tra-оперона.

Tra-оперон обуславливает возможность процесса конъюгации (детерминирует образование конъюгативных пилей и процесс одностороннего переноса через них генетического материала: плазмиды или участка нуклеоида).

F-плазмиды.

F-плазмиды представляют собой собственно tra-оперон, без каких-либо дополнительных генов, они детерминирует перенос при конъюгации себя, а также другую молекулу ДНК, в которую интегрирована F-плазмида (если это молекула ДНК – неконъюгационная плазмида, то в результате интеграции F-плазмиды она становится конъюгационной и передаётся через конъюгационную пилю, если это молекула ДНК – нуклеоид, то при конъюгации передаётся его часть, но не сама F-плазмида).

Формирование различных состояний плазмиды F.

F-плазмида из автономного состояния может переходить в интегрированное в нуклеоид состояние (в этом случае она называется Hfr-фактором), а также возвращаться в автономное состояние (или полностью сохраняя свой состав или «обмениваясь» с нуклеоидом своим концевым участком – в последнем случая такая рекомбинантная плазмида называется F’-плазмидой).

R-плазмиды.

R-плазмиды – это плазмиды, детерминирующие множественную лекарственную устойчивость (или резистентность, откуда и название) бактериальной клетки к антибиотикам; они состоят из генов, детерминирующих такую устойчивость (r-оперон) и F-плазмиды (которая в этом случае носит название RTF-фактора.

Состав r-оперона.

Этот оперон содержит гены, детерминирующие устойчивость к антибиотикам, а также в его состав может входить транспозон или его часть – IS-пос­ледовательность.

Механизмы устойчивости бактерий к антибиотикам, обусловленные наличием R-плазмид.

R-плазмида может детерминировать: способность бактериальной клетки инактивировать антибиотик, способность бактериальной клетки модифицировать антибиотик с потерей последним своей антибактериальной активности, способность бактериальной клетки снижать проницаемость клеточной стенки для данного антибиотика.

Бактериоциногенные плазмиды (на примере col-плазмиды E.coli).

Бактериоциногенные плазмиды детерминируют синтез антибиотикоподобных веществ – бактериоцинов; у кишечной палочки бактериоциногенные плазмиды называются колициногенными (как и у других бактерий – по названию вида) или Col-плазмидами, а бактериоцины – колицинами (по такому же принципу).

Характеристика колицинов.

Колицины представляют собой белки, которые убивают бактериальную клетку, но не лизируют её.

Транспозоны.

Транспозоны – нуклеотидные последовательности, включающие в себя IS-последовательности (которые обуславливают способность транспозонов менять место локализации в молекуле ДНК, а также «перескакивать» из одной молекулы ДНК в другую – так называемые «прыгающие гены»), гены, детерминирующие какой-либо признак, а также особые концевые структуры, благодаря которым транспозоны могут находиться в автономном состоянии (поскольку, благодаря этим «липким концам» замыкаются в кольцо).

IS-последовательности.

IS-последовательности включают в себя только гены транспозиции, в отличие от транспозонов не могут находиться в автономно состоянии.

Механизмы фаговой конверсии.

Когда в результате лизогенизации (т.е. встраивание в геном умеренного бактериофага) бактерия приобретает дополнительный признак, это может быть обусловлено тремя возможными механизмами: дерепрессией гена профага, внесением соответствующего гена дефектным фагом, запуском «молчащего» из-за повреждения собственного промотора гена промотором профага.

Модификации у бактерий.

Модификациями называются фенотипическая изменчивость у бактерий.

Мутации у бактерий.

При мутационной изменчивости у бактерий происходят изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака (или признаков); при спонтанных мутациях факторы, их вызвавший (мутаген) не известен – наиболее часто спонтанные мутации происходят в результате ошибки ДНК-полимеразы при репликации ДНК, среди спонтанных мутаций выделяют инсертационные мутации, которые происходят вследствие встраивания в нуклеоид внехромосомных факторов наследственности; индуцированные мутации у бактерий вызываются в эксперименте действием конкретного мутагена.

SR-диссоциации.

SR-диссоциацией называется такое явление, когда в чистой культуре, образующей S-формы колоний, появляются R-формы; по своему механизму SR-диссоциация – это инсертационная мутация, приводящая к утрате генов, контролирующих синтез полисахаридных звеньев ЛПС наружной мембраны клеточной стенки.

Мутагены.

Под мутагенами понимают химические вещества или физические факторы, вызывающие предмутационные изменения в ДНК, которые в результате ошибок репарирующих ферментов или в процессе репарации переходят в мутацию.

Репарации у бактерий.

Этим термином обозначают процесс восстановления повреждённой ДНК ферментами репарационных систем бактериальной клетки.

Рекомбинационная изменчивость у бактерий.

Под рекомбинационной изменчивостью понимают изменчивость, происходящую в результате включения в ДНК реципиентной клетки участка ДНК донорской клетки; у бактерий насчитывают пять видов генетических рекомбинаций (т.е. пять видов рекомбинационной изменчивости): трансформация (непосредственная передача генетического материала от донорской к реципиентной клетке), трансдукция (передача генетического материала от донорской к реципиентной клетке с помощью дефектных бактериофагов), конъюгация (передача генетического материала от донорской к реципиентной клетке с помощью конъюгационных пилей), лизогенизация (при ней в геном реципиентной клетки внедряется экзогенный генетический материал – геном умеренного фага), фаговая конверсия (отличается от лизогенизации лишь тем, что фенотип донорской клетки изменяется).

Генная инженерия в медицинской микробиологии.

В медицинской микробиологии все шире используются методы генной инженерии, с помощью которых «заставляют» микроорганизмы продуцировать нужные медицинской практике препараты (вакцины, гормоны, интерфероны, цитокины и др.), путем внесения в их геном соответствующего гена, т.е. получения рекомбинантного штамма с нужными свойствами путем «направленной» рекомбинационной изменчивости.

Генетические методы, применяемые в микробиологической диагностике.

В современной медицине все большее распространение получают генетические методы микробиологической диагностики: определение процентного содержания гуанина и цитозина в бактериальном геноме, метод молекулярной гибридизации и особенно – полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Метод молекулярной гибридизации.

Этот метод используется для выявления степени сходства различных ДНК (при идентификации микроорганизмов проводят сравнение ДНК выделенного штамма с ДНК эталонного штамма).

Полимеразная цепная реакция.

ПЦР можно проводить для достижения трех целей: для обнаружения в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без выделения чистой культуры, для идентификации выделенных чистых культур микроорганизмов, для генотипирования микроорганизмов, т.е. определения генетических вариантов одного вида; принцип осуществления ПЦР заключается в увеличении (амплификации) количества искомого гена при положительной или отсутствии такого увеличения при отрицательной реакции (т.е. проводится экстракция ДНК и, если в ней содержится искомый ген, ее количество в процессе реакции резко увеличивается, что выявляется с помощью электрофореза).

Б. Лекционный курс

В. Теоретический материал

11. Организация генетического материала у бактерий
11.2. Плазмиды
11.3. F-плазмиды
11.4. R-плазмиды
11.6. Транспозоны
11.7. IS-последовательности
12. Модификации, мутации и репарации у бактерий
12.1. Модификации у бактерий
12.2. Мутации у бактерий
12.3. SR-диссоциация
12.4. Мутагены
12.5. Репарации
13. Генетические рекомбинации у бактерий, генная инженерия в медицинской микробиологии
13.1. Виды генетических рекомбинаций у бактерий
13.2. Генная инженерия в медицинской микробиологии
14. Применение генетических методов в микробиологической диагностике
14.1. Метод молекулярной гибридизации
14.2. Полимеразная цепная реакция

ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У БАКТЕРИЙ

11.1. Общая схема организации генетического материала бактериальной клетки

Организация генетического материала у бактерий основана на общем для всех форм на Земле принципе. Поэтому данный материал излагается с учетом знания студентами курса общей генетики: освещаются лишь те генетические особенности, которые характерны для прокариотической клетки. Наследственная информация бактерий, как и у всех форм клеточной жизни (в отличие от вирусов), хранится в ДНК (Рис. 11.1-1), которая в прокариотической клетке представлена двумя типами молекул.

Рис. 11.1-1. Схема строения ДНК

А. Жизненно важные признаки, без которых бактериальная клетка не может существовать, закодированы в нуклеоиде (см. раздел 4.2).

Б. Не жизненно важные признаки закодированы у бактерий во внехромосомных факторах наследственности : плазмидах, транспозонах, IS-последовательностях и умеренных бактериофагах. Без этих признаков бактериальная клетка может существовать в обычных условиях, но дополнительные признаки, закодированные во внехромосомных факторах наследственности, придают ряду клеток популяции дополнительные возможности выживания при изменении условий внешней среды и, за счет повышения гетерогенности популяции, усиливают адаптационные возможности последней. Например, признак устойчивости к пенициллину в обычных условиях не востребован и не влияет на жизнеспособность бактериальной клетки, но при появлении этого антибиотика во внешней среде выжить могут только те бактерии, которые имеют плазмиду, кодирующую соответствующий признак. А выжить в присутствии пенициллина смогут только те бактериальные популяции, в составе которых есть клетки, несущие соответствующую плазмиду.

1. По способности к саморепликации внехромосомные факторы наследственности делятся на две группы: автономные и неавтономные.

а. Автономными внехромосомными факторами наследственности у бактерий являются плазмиды. Это значит, что они способны реплицироваться самостоятельно, обладая собственным соответствующим опероном.

б. Неавтономными внехромосомными факторами наследственности у бактерий являются транспозоны, IS-последовательности и умеренные фаги. Не обладая собственным опероном, обеспечивающим репликацию, они могут реплицироваться только в молекуле ДНК, обладающей таким опероном – или в нуклеоиде или в плазмиде.

2. Все внехромосомные факторы наследственности у бактерий могут встраиваться в нуклеоид (и, соответственно, выходить из его состава). В зависимости от места встраивания в нуклеоид внехромосомные факторы наследственности также делятся на две группы.

а. Только в гомологичных участках могут встраиваться в нуклеоид плазмиды и умеренные бактериофаги. Это значит, что для конкретной плазмиды и для конкретного умеренного бактериофага есть только одно место в нуклеоиде, где эта конкретная плазмида или этот конкретный бактериофаг могут включиться в состав нуклеоида.

б. В любых участках могут встраиваться в нуклеоид транспозоны и IS-последовательности.

11.2. Плазмиды

Плазмиды – внехромосомные автономные факторы наследственности у бактерий.

А. Плазмиды, как и другие внехромосомные факторы наследственности бактерий, увеличивают генетическую гетерогенность бактериальной популяции. Это и можно рассматривать как их основную функцию, которые они выполняют вместе с транспозонами, IS-последовательностями и умеренными бактериофагами. Конкретно же плазмиды выделяют две функции : регуляторную и кодирующую.

1. Плазмиды могут нести те же гены, которые имеются в нуклеоиде. Если один из этих генов нуклеоида по какой-либо причине «замолчит», то «включиться идентичный гены плазмиды – нужный признак по-прежнему будет присутствовать в фенотипе бактериальной клетки. Эта функция плазмид называется регуляторной .

2. Кодирующая функция плазмид заключается в том, что в них могут находиться гены, отсутствующие в бактериальной хромосоме (т.е. нуклеоиде). Собственно эта функция плазмид совпадает с общей функцией всех внехромосомных факторов наследственности – повышать гетерогенность генотипа популяции.

Б. Как и большинство других внехромосомных факторов наследственности, плазмиды могут существовать в бактериальной клетке в двух состояниях .

1. Если плазмида находится вне нуклеоида, в цитоплазме, говорят о ее автономном состоянии (не путать с понятием «автономный фактор наследственности»).

2. Плазмида, включенная в состав нуклеоида, находится в интегрированном состоянии.

В. В зависимости от содержания tra-оперона (о котором подробнее будет сказано ниже) плазмиды также делятся на две группы.

1. Плазмиды, содержащие в своем состав tra-оперон, называются конъюгативными , потому что такие плазмиды могут обуславливать передачу генетического материала от донорской клетки к реципиентной в процессе конъюгации (см. раздел 13.1).

а. Tra-оперон детерминирует образование конъюгативных пилей .

б. Кроме этого tra-оперон детерминирует цепь событий, которая называется мобилизацией на перенос . При этом участок двухцепочечной ДНК сначала расплетается, затем одна его цепочка переходит через конъюгативную пилю в другую, реципиентную, бактериальную клетку, где уже достраивается комплиментарная вторая нить. Таким образом, донорская клетка при конъюгации не теряет генетический материал, а реципиентная – приобретает его (несмотря на кажущийся смысл определения конъюгации как «перенос генетического материала от донорской к реципиентной клетке с помощью конъюгативных пилей).

1 . Tra-оперон может мобилизовывать на перенос саму конъюгативную плазмиду (как это происходит в случае передачи при конъюгации плазмиды F + , см. раздел 11.3).

2 . Tra-оперон может мобилизовывать на перенос другую, неконъюгативную, плазмиду (как это происходит в случае передачи при конъюгации плазмиды RTF, см. раздел 11.4).

3 . Tra-оперон может мобилизовывать на перенос участок нуклеоида донорской клетки (как это происходит при конъюгации, обусловленной плазмидой Hfr, см. раздел 11.3).

2. Плазмиды, не несущие tra-оперона, называются, соответственно, неконъюгативными , т.к. не способны обуславливать процесс конъюгации.

Г. На две группы делятся плазмиды и по степени контроля над их репликацией со стороны нуклеоида.

1. Большие плазмиды (т.е. имеющие относительно большой молекулярный вес) находятся под строгим контролем со стороны нуклеоида над своей репликацией. Нуклеоид «позволяет» им, как правило, лишь одно «лишнее» деление. Соответственно в клетке такие плазмиды находятся в одной или двух копиях.

2. Малые плазмиды (т.е. имеющие относительно малый молекулярный вес) находятся под ослабленным контролем со стороны нуклеоида над своей репликацией и могут делиться значительно чаще его – поэтому в бактериальной клетке может одновременно находится до 30 копий таких плазмид.

Д. Наконец, плазмиды классифицируются на группы несовместимости . Дело в том, что родственные плазмиды не могут одновременно находиться в одной бактериальной клетке, т.к. если одна из них уже в ней присутствует, то другая проникнуть в нее уже не сможет (такое явление называется иммунитет к суперинфекции и касается также взаимоотношения вирусов с чувствительной клеткой). В результате родственные друг другу плазмиды, не совместимые в одной клетке, составляют одну группу несовместимости. В настоящее время таких групп несовместимости насчитывается среди плазмид более двадцати.

11.3. F-плазмиды

F-плазмиды представляют собой собственно tra-оперон, без каких-либо дополнительных генов. Эту плазмиду называют еще половым фактором или фактором фертильности (откуда и название) потому что наличие F-плазмиды превращает клетку в возможного донора наследственного материала при конъюгации (т.е. в «мужскую» клетку), соответственно клетка, лишенная F-плазмиды, является потенциальным реципиентом генетического материала при конъюгации («женской» клеткой). Реципиентная клетка, получив при конъюгации F-плазмиду, превращается тем самым из женской в мужскую (т.е. происходит «смена пола»).

А. F-плазмида, находящаяся в интегрированном состоянии, носит название Hfr-плазмиды (high frequency of recombination – высокая частота рекомбинации). Если донорская клетка при конъюгации содержит Hfr-фактор, то при конъюгации разрыв цепочки нуклеоида происходит в месте прикрепления этого фактора и в конъюгационный мостик начинает входить противоположенный от места нахождения Hfr-фактора конец ДНК. Так как конъюгационный мостик не стоек, контакт между клетками при конъюгации кратковременен и вся цепочка ДНК нуклеоида просто не успевает перейти в реципиентную клетку. Следовательно, сам Hfr-фактор при этом виде конъюгации не передается (не происходит смена пола), а внедрившийся в реципиентную клетку фрагмент нуклеоида с высокой частотой (т.к. конъюгация происходит, как правило, между клетками одного вида) рекомбинирует с хромосомой реципиентной клетки.

Б. F-плазмида , находясь в автономном состоянии, сама переходит при конъюгации в реципиентную клетку. При этом реципиентная клетка превращается из «женской» в «мужскую» (т.е. происходит смена пола), но внедрившийся в реципиентную клетку генетический материал, представленный плазмидным генами, редко рекомбинирует с бактериальной хромосомой, потому что имеет по отношению к хромосомному генетическому материалу сравнительно низкую степень гомологии.

В. Половой фактор может переходить из автономного состояния в интеграционное и из интеграционного – в автономное. Последний процесс может сопровождаться обменом прилегающих частей плазмиды и нуклеотида, в результате чего перешедшая в автономное состояние плазмида окажется рекомбинационной – будет содержать фрагмент нуклеоида, оставив в нем взамен него свой фрагмент. Такая плазмида обозначается как F’-плазмида . Если донорская клетка при конъюгации несет F’-плазмиду, то она переходит в реципиентную клетку, производя у последней «смену пола», но при этом и обуславливает высокую частоту рекомбинации (благодаря включенному фрагменту нуклеоида). Формирование различных состояний F-плазмиды, описанное выше иллюстрируется на Рис. 11-3-1.

11.4. R-плазмиды

R-плазмиды – это плазмиды, детерминирующие множественную лекарственную устойчивость (или резистентность, откуда и название) бактериальной клетки к антибактериальным веществам (прежде всего антибиотикам).

А. Состав R-плазмиды определяется наличием в нем двух основных оперонов. Поэтому эта плазмида может находиться в двух формах.

1. Если в состав R-плазмиды входит tra-оперон, то в этом случае R-плазмида является конъюгативной . Tra-оперон в составе этой плазмиды называется RTF-фактор (resistance transfer factor – фактор, передающий устойчивость). Гены, детерминирующие устойчивость к антибиотикам, формируют так называемый r-оперон (если быть более точным, то устойчивость к каждому антибиотику детерминирует отдельный r-оперон – т.е. в состав R-плазмиды входит несколько r-оперонов), который, в свою очередь, тоже может существовать как самостоятельная плазмида. Другими словами, конъюгативная R-плазмида состоит из двух плазмид: RTF-фактора и r-фактора (что можно понимать как включение меньшей r-плазмиды в состав большей RTF-плазмиды).

2. Неконъюгативная форма этой плазмиды состоит только из r-оперона(-ов).

Б. В состав r-оперона может входить множество генов.

1. Во-первых, это гены, детерминирующие синтез специфических ферментов .

а. Это могут быть ферменты, инактивирующие антибиотик .

б. Или ферменты, модифицирующие антибиотик . При этом модифицированный антибиотик (например, фосфорилированный) теряет свою антибактериальную активность.

в. Наконец, это могут быть ферменты, которые снижают проницаемость клеточной стенки к данному антибиотику, в результате чего он не может проникнуть внутрь бактериальной клетки и «добраться» до мишени своего действия (например, до рибосом, чтобы блокировать здесь синтез белка).

2. И во-вторых, r-оперона может содержать целый транспозон или его часть – IS-пос­ледовательность (см. ниже).

В. Из состава r-оперона становятся понятны основные механизмы устойчивости бактерий к антибиотикам , обусловленные наличием R-плазмид. Их три.

1. R-плазмида может детерминировать способность бактериальной клетки инактивировать антибиотик .

2. Или R-плазмида может детерминировать способность бактериальной клетки таким образом модифицировать антибиотик , что он в результате потеряет свою антибактериальную активность.

3. И, наконец, R-плазмида может детерминировать снижение проницаемости клеточной стенки для данного антибиотика и, таким образом, закрыть ему доступ к мишени его действия.

Г. R-плазмида не всегда передается посредством конъюгации.

1. У грамположительных бактерий R-плазмида чаще всего передается посредством трансдукции .

2. Посредством конъюгации R-плазмида чаще всего передается у грамотрицательных бактерий.

11.5. Бактериоциногенные плазмиды (на примере Col-плазмиды E.coli)

Бактериоциногенные плазмиды присущи практически всем видам бактерий. Они детерминируют синтез антибиотикоподобных веществ – бактериоцинов. Мы рассмотрим эти плазмиды на примере кишечной палочки. У нее бактериоциногенные плазмиды называются колициногенными (как и у других бактерий – по названию вида) или Col-плазмидами (наиболее многочисленная группа колициногенных плазмид), а бактериоцины – колицинами (по такому же принципу).

А. Состав Col-плазмиды определяется наличием в нем двух основных оперонов.

1. Эта плазмида содержит, во-первых, гены, детерминирующие синтез колицинов .

а. Колицины представляют собой белки .

б. Насчитывается более 25 типов колицинов.

в. Колицины не действуют на клетку, несущую колициногенную плазмиду идентичного типа.

г. Колицины убивают бактериальную клетку, но не лизируют ее, что предотвращает появление в среде обитания оставшихся в живых бактерий токсических продуктов клеточного распада.

2. И, во-вторых, Col-плазмида содержит tra-оперон . Соответственно она относится к конъюгативным плазмидам.

Б. Col-плазмида отличается от других плазмид рядом присущих только ей особенностей .

1. В отличие от других конъюгативных плазмид Col-плазмида редко интегрирует в нуклеоид. Хотя все конъюгативные плазмиды по определению способны это делать, иначе они не смогли бы мобилизовывать на перенос участок бактериальной хромосомы (см. раздел 11.3.А).

2. Col-плазмида обычно репрессирована , т.е. информация с нее не снимается. Т.е. признак, который она детерминирует, в обычных условиях клетке не нужен.

3. Когда же данный признак становится востребован и Col-плазмида дерепрессируется, то бактериальная клетка синтезирует колицины и погибает. Другими словами, Col-плазмида является потенциально летальной .

В. Значение Col-плазмиды можно рассматривать с двух точек зрения.

1. Биологическое значение Col-плазмиды заключается в том, что с ее помощью достигается разрежение популяции при недостатке питательного субстрата. Происходит это по следующей схеме (Рис. 11.5-1).

а. В популяции присутствуют клетки с различными типами Col-плазмиды (на рисунке помечены различным цветом). При истощении питательной среды Col-плазмида в одной из клеток дерепрессируется, эта клетка синтезирует соответствующий тип колицина и погибает.

б. Колицины действуют только на те клетки, которые не содержат Col-плазмиду, детерминирующую синтез колицинов именно этого типа. Соответственно клетки, содержащие Col-плазмиду, детерминирующую синтез колицинов данного типа остаются живыми.

в. Все же другие клетки популяции, несущие Col-плазмиды других типов, погибают, популяция разряжается («едоков» становится меньше) и, как результат, может продлить свою жизнь на обедненной среде.

2. Медицинское значение Col-плазмида плазмиды заключается в том, что с ее помощью кишечные палочки, в норме заселяющие кишечник человека, регулируют нормальный микробиоценоз – совокупность микроорганизмов, населяющих кишечных здорового человека, так как колицины действуют не только на клетки своего вида, но и на клетки других видов бактерий кишечной группы.

11.6. Транспозоны

Транспозоны, впрочем, как и IS-последовательности, часто называют «прыгающими генами». Вследствие своей способности, в отличие от плазмид и умеренных фагов, внедряться в молекулу ДНК (нуклеоид, плазмиду или умеренный фаг) в любых, а не только в гомологичных, участках, они могут менять место своей локализации в той молекуле ДНК, в которой они интегрированы. Кроме того, они могут «перескакивать» также и из одной молекулы ДНК в другую.

А. Транспозонам обычно дается следующее определение : это нуклеотидные последовательности (от 2 000 до 20 000 пар нуклеотидов), способные менять место своей локализации в молекуле ДНК и мигрировать из одной молекулы ДНК в другую.

Б. В бактериальной клетке они могут находиться в двух состояниях .

1. Транспозон может находиться в интегрированном состоянии, т.е. быть встроенным в репликон (нуклеоид или плазмиду) и, соответственно, реплицироваться в составе этого репликона.

2. Транспозон может находиться в бактериальной клетке и в автономном состоянии (т.е. вне репликона). В этом случае он замыкается в кольцо, но, будучи не в состоянии самореплицироваться, при делении клетки переходит только в одну из двух вновь образованных.

В. Транспозон состоит из трех основных частей.

1. Он содержит особые концевые структуры , которые отличают транспозон от других фрагментов ДНК, встречающихся в бактериальной клетке, и являющихся, таким образом, маркерами именно этого внехромосомного фактора наследственности.

2. Способность транспозона менять место своей локализации в молекуле ДНК и мигрировать из одной молекулы ДНК в другую детерминируют особые гены транспозиции (собственно, это и есть IS-последовательности).

3. Кроме этого, транспозон содержит гены, детерминирующие синтез белков , обуславливающих наличие у содержащей данный транспозон бактериальной клетки дополнительных признаков.

а. Часто такие гены детерминируют способность бактериальной клетки синтезировать тот или иной белковый токсин .

б. Не менее часто транспозон детерминирует устойчивость клетки к какому-либо антибиотику (именно одному, в отличие от R-плазмиды).

в. Реже транспозон детерминирует синтез белков, обуславливающих другие признаки .

11.7. IS-последовательности

IS-последовательности (insert sequences – вставные последовательности) входят в состав транспозона, обеспечивая его способность к транспозиции.

А. IS-последовательностям обычно дается следующее определение : это вставки нуклеотидных последовательностей (порядка 1 000 пар нуклеотидов), способных к транспозиции.

Б. IS-последовательности принципиально отличаются от транспозонов .

1. Во-первых, они содержат только гены транспозиции .

2. Во-вторых, они не обнаружены в свободном состоянии .

В. IS-последовательности выполняют три основные функции .

1. С их помощью осуществляется координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации.

2. Кроме этого они могут осуществлять регуляторную функцию (т.е. регулировать транскрипции генов путём их «включения/выключения»).

3. Наконец, IS-последовательности могут индуцировать мутации (инверсии, дупликации на протяжении 5-9 пар нуклеотидов).

11.8. Механизмы фаговой конверсии

Здесь, после изложения сведений о бактериофаге и о внехромосомных факторах наследственности у бактерий, можно обобщить сведения о механизмах фаговой конверсии (см. раздел 10.4.Б.2), когда в результате лизогенизации (т.е. встраивание в геном умеренного бактериофага) бактерия приобретает дополнительный признак.

А. Во-первых это явление может быть обусловлено дерепрессией гена профага , как об этом было сказано выше (см. раздел 10.4.Б.2).

Б. Во-вторых дополнительный признак может детерминироваться геном бактерии-донора, внесенным в геном бактерии-реципиента дефектным фагом при специализированной трансдукции (см. раздел 10.4.В.2).

В. И в-третьих, если умеренный бактериофаг интегрировался около поврежденного промотора одного из генов, то функцию этого неработающего промотора может «взять на себя» промотор профага, восстановив тем самым экспрессию «молчавшего» гена бактерии-реципиента.

Похожая информация.